无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法技术

本发明专利技术公开了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；它是生物安全外源蛋白表达系统，以asd缺失株E.coli 6212/Δasd和alr缺失L.plantarum NC8/Δalr为宿主菌，将来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris strain JM4）基因组上P23启动子作为alr基因表达的启动子，以pYA4545，pYA4545‑Mcherry，pLP‑1261 Inv，pSIP409PgsA’，pSIP409PgsA’‑IL‑10，pSIP409PgsA’‑EGFP为基础载体，构建以PgsA’和LP‑1261为双锚定模型的营养互补筛选标记大肠杆菌‑乳酸菌无抗锚定表达载体pLQ2a，并以EGFP及Mcherry作为报告基因进行筛选及锚定表达验证；解决了植物乳杆菌连接转化效率低，很难筛选到阳性重组子的问题，构建表达载体pLQ2既能在E.coli 6212/Δalr中复制表达，又能在L.plantarum NC8/Δalr中表达。

Double antigen anchoring expression vector pLQ2a without resistance screening and its preparation method

The invention discloses an anchored expression vector pLQ2a of Lactobacillus plantarum, whose base sequence is shown as SEQ ID NO.1; it is a biosafety exogenous protein expression system with E.coli 6212/asd and L.plantarum NC8/alr deleted as host bacteria and will be derived from Lactococcus lactis subsp.cremor. P23 promoter was used as the promoter of ALR gene expression on the genome of IS strain JM4. PgsA'and LP'were used as complementary markers for E. coli based on pYA4545, pYA4545 Mcherry, pLP_1261 Inv, pSIP40PgsA', pSIPgsA'IL_10, pSIPgsA'EGFP. _Lactobacillus sp. pLQ2a was used as a Non-anchoring expression vector, and EGFP and Mcherry were used as a reporter gene for screening and anchoring expression verification. The problem of low efficiency of ligation and transformation of Lactobacillus plantarum was solved, and it was difficult to screen positive recombinants. The constructed expression vector pLQ2 could be replicated and expressed in E.coli 6212/alr as well as in L.plantarum NC. Expression in 8/ delta ALR.

【技术实现步骤摘要】
无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法。
技术介绍
植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，L.plantarum）作为一种肠道宿主菌株可耐受胃内低pH值、高盐的环境，最适生长温度为30-37℃，能耐受10℃左右的低温，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌符合美国食品与药品管理局（FDA）的GRAS（GenerallyRecognizedasSafe）规定以及欧洲食品安全局（EFSA）的安全资格认证（QualifiedPresumptionofSafety）标准，通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。pSIP409系列质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备pUC来源于大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）和256rep来源于植物乳杆菌两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达。但该系列质粒载体使用了红霉素抗性基因(erythromycin，EM)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，Nguyen等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。所以我们要用非抗生素筛选标记代替该载体的抗生素抗性基因并使改建后载体能在受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr（L.plantarumNC8/Δalr）中稳定复制表达外源蛋白，从而使我们的乳酸菌制品达到对机体无害要求。丙氨酸消旋酶（AlanineRacemase，alr）基因广泛存在于原核生物基因组中，该基因可将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是细胞壁中重要的交联成分，是菌株生长的必需物质，因此该酶对原核细胞的生长至关重要。虽然绝大多数微生物都含有两种丙氨酸消旋酶基因：生物合成型（BiosyntheticAlanineRacemase，alr)和代谢型（CatabolicAlanineRacemase，dadX/B），但对于乳酸乳球菌和乳酸杆菌来说，丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通MRS培养基中不生长，只有在额外添加D-丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通MRS培养基中不生长，只有在额外添加D-丙氨酸的培养基中生长，利用alr基因作为筛选标记相关研究在国外已有成功的范例，在选择压力下，带有alr标记的质粒具有较高的稳定性，并且在绝大多数发酵培养基中不会出现D-丙氨酸，因此本研究采用alr基因作营养互补型植物乳杆菌非抗生素性筛选标记。大肠杆菌asd基因编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶，是二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的关键酶，DAP是革兰氏阴性菌细胞壁上肽聚糖的基本成分，asd基因发生缺失突变后，由于不能合成细胞壁而导致溶菌死亡。因此选用大肠杆菌asd基因缺失株E.coli6212/Δasd作为中间宿主菌，可以解决植物乳杆菌连接转化效率低，很难筛选到阳性重组子的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决植物乳杆菌细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌及植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，而提供一种既能在E.coli6212/Δalr中复制又能在L.plantarumNC8/Δalr中锚定表达的无抗性筛选锚定表达载体pLQ2a。植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a的制备方法，它包括：1）双锚定表达载体命名为pSIP409PgsA’-1261的制备参照质粒pLP-1261Inv上LP-1261基因序列设计含有同源手臂端的无缝克隆引物，并在LP-1261的上游添加SD序列（AGGAAACAGACC）和HindⅢ酶切位点，下游添加SalI和HindⅢ酶切位点，扩增含有同源手臂端298bp的LP-1261序列，引物序列如下：1261F:TTCGAAGGCGCCAAGCTTAGGAAACAGACCATGAATTTCAAAACAGCT1261R:CACGTGCTGTAATTTGAAGCTTGTCGACCGCCGCAATCGTGCC；将锚定表达载体pSIP409PgsA’用HindⅢ单酶切，获得线性化载体pSIP409PgsA’（HindⅢ）6202bp；将锚定序列LP-1261与pSIP409PgsA’无缝克隆连接，将连接产物化学法转化E.coliTOP10感受态细胞，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，获得双锚定表达载体命名为pSIP409PgsA’-1261；2）P23-alr-asd基因制备参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因，P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因并人工合成（大小3027bp），其碱基序列如SEQIDNO.2所示；3）用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素（EM）基因获得无抗性筛选标记锚定表达载体pLQa用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素基因，参照基因序列pSIP409PgsA’-1261设计引物，扩增去除红霉素基因5405bp的409PgsA’-1261片段，引物如下：LPSF:TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTGLPSR:GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC；将扩增的409PgsA’-1261纯化后与P23-alr-asd无缝克隆连接，电转化E.coli6212/Δasd感受态细胞，铺普通LB固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的双抗原锚定表达质粒命名为pLQa；4）pLQ2a载体构建引入三个HindⅢ酶切位点，将alr基因内的HindⅢ酶切位点AAGCTT突变为AAACTT，点突变引物如下：HindF:CCAGTCTCTGGCATCAAACTTGCAATGGCAACHindR:TTTGATGCCAGAGACTGGTGGCCGAATTGGAC；同时载体上还含有两处SalI酶切位点，将alr基因下游的SalI酶切位点GTCGAC突变GTAGAC，引物如下：1261ATTF:CACTACCTGATGTTGTAGACGAAAAGCCCTGAC1261ATTR:TACAACATCAGGTAGTGACACTTCTTTGACCTG；以质粒pLQa为模板PCR扩增产物纯化后，用DpnI限制性内切酶处理后，电转化E.coli6212/Δasd感受态细胞，经过两次突变后的筛选阳性载体命名为pLQ2a，载体总计8432bp。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。2.植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a的制备方法，它包括：1）双锚定表达载体命名为pSIP409PgsA’-1261的制备参照质粒pLP-1261Inv上LP-1261基因序列设计含有同源手臂端的无缝克隆引物，并在LP-1261的上游添加SD序列（AGGAAACAGACC）和HindⅢ酶切位点，下游添加SalI和HindⅢ酶切位点，扩增含有同源手臂端298bp的LP-1261序列，引物序列如下：1261F:TTCGAAGGCGCCAAGCTTAGGAAACAGACCATGAATTTCAAAACAGCT1261R:CACGTGCTGTAATTTGAAGCTTGTCGACCGCCGCAATCGTGCC；将锚定表达载体pSIP409PgsA’用HindⅢ单酶切，获得线性化载体pSIP409PgsA’；将锚定序列LP-1261与pSIP409PgsA’无缝克隆连接，将连接产物化学法转化E.coliTOP10感受态细胞，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，获得双锚定表达载体pSIP409PgsA’-1261；2）P23-alr-asd基因制备参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因、P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示；3）用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素基因获得无抗性筛选标记锚...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春凤，刘琼，姜延龙，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22