本发明专利技术提供了一种pnCasSA‑BEC质粒及其应用。所述的pnCasSA‑BEC质粒，其序列为SEQ ID NO：1。本发明专利技术能够的质粒(1)能够在各种金黄色葡萄球菌菌株中高效快速地进行碱基编辑，其中包括碱基突变和基因失活；(2)能够通过DNA复制机制实现碱基编辑而不会损失转化CFU，获得极高的转化效率。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。
A pnCasSA-BEC plasmid and its application
The invention provides a pnCasSA BEC plasmid and its application. The pnCasSA BEC plasmid has a sequence of SEQ ID NO:1. The plasmid (1) can perform base editing efficiently and quickly in various strains of Staphylococcus aureus, including base mutation and gene inactivation; (2) can realize base editing through DNA replication mechanism without losing CFU transformation, and obtain extremely high conversion efficiency. The technology has broad application prospects in the treatment of Staphylococcus aureus infection, the discovery of drug targets, the development of drugs, and the physiological research of Staphylococcus aureus.
【技术实现步骤摘要】
一种pnCasSA-BEC质粒及其应用
本专利技术涉及一种pnCasSA-BEC质粒及其应用。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原体细菌，可以引发各种各样的感染疾病，既能引起轻微的皮肤感染，也能造成危及生命的重大感染，例如毒素休克综合症、坏死性肺炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌具有超强的感染力主要归因于其精致的毒力调控系统、分泌的多种多样的细胞毒素以及多功能的细胞表面蛋白，如聚集因子、纤粘蛋白结合蛋白、胶原蛋白结合蛋白等。这些表面蛋白通过与人体细胞直接作用，能够使金黄色葡萄球菌逃避宿主免疫反应、促进其生物膜的形成和细菌定植等，为其生长创造一系列有利条件。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)的爆发给治疗金黄色葡萄球菌感染带来极大挑战。因此，迫切需要开发针对耐药性金黄色葡萄球菌的新型治疗手段。高效基因组编辑技术对研究基因功能、发现新型药物靶标以及开发新型治疗手段具有重大意义。传统的在金黄色葡萄球菌中的基因组编辑技术主要是通过分步的双交换过程实现。此类方法步骤繁琐，费时费力。近期开发的金黄色葡萄球菌中的CRISPR/Cas9基因组编辑技术(pCasSA)一步实现基因组编辑，大大缩减了金黄色葡萄球菌中的编辑步骤。然而，此技术仍旧需要利用同源修复模板并且会大大降低编辑后细菌成活率，因而限制了其在许多转化效率低下的临床菌株中的应用。近期，“碱基编辑器”的专利技术为金黄色葡萄球菌中的基因编辑提供了新的途径。它能够通过催化反应，直接实现基因组上的碱基变换。到目前为止，人们已经专利技术了两种碱基编辑器(胞嘧啶编辑器和腺嘌呤编辑器)，它们分别由失活的Cas9(Cas9D10A，H840A)蛋白或Cas9nickase(Cas9D10A)和脱氨基酶组成。胞嘧啶脱氨酶可通过Cas9/sgRNA复合物导向基因组的任何位点，在Cas9nickase/sgRNA结合后产生的单链DNA中，将胞嘧啶转化成尿嘧啶以实现碱基编辑。CRISPR/Cas9基因组编辑方法依赖于同源重组修复机制(在细菌中)，并且需要供体修复模板。相比于产生双链断裂的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，碱基编辑器通过脱氨基反应直接催化胞嘧啶转化成尿嘧啶，同时切割未编辑的链，并使用DNA复制机制实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化。此类方法由于不涉及基因组双链断裂，因而不会损失转化CFU。以下项目得到国家自然科学基金，项目编号：91753127；项目名称：细菌细胞壁回收调控机制以及生物学功能探究；国家自然科学基金，项目编号：31700123；项目名称：利用CRISPR/Cas9筛选金黄色葡萄球菌中影响生物膜形成的细胞壁表面蛋白；上海市科委，项目编号：17ZR1449200；项目名称：基于新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9的高效天然产物合成基因簇的抓取技术开发；以及科技部重点研发计划，项目编号：2017YFA0506800；项目名称：信使RNA腺嘌呤m6A甲基转移酶复合机器的工作机理的资助。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种pnCasSA-BEC质粒及其应用。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，其序列为SEQIDNO：1。本专利技术还提供了一种pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，含有APOBEC1蛋白和Cas9nickase蛋白基因表达的启动子、APOBEC1蛋白基因片段、APOBEC1蛋白基因和Cas9nickase蛋白基因的连接区域以及Cas9nickase蛋白基因片段。优选地，所述的pnCasSA-BEC质粒还含有金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子、金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段、大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片段、大肠杆菌中的质粒复制子、酶切位点、sgRNA表达的启动子以及sgRNA。本专利技术还提供了上述的pnCasSA-BEC质粒在金黄色葡萄球菌株中高效碱基编辑的应用。本专利技术还提供了上述的pnCasSA-BEC质粒在金黄色葡萄球菌株中高效基因失活的应用。本专利技术还提供了上述的pnCasSA-BEC质粒在金黄色葡萄球菌株中高效基因突变的应用。本专利技术还提供了含有上述的pnCasSA-BEC质粒的大肠杆菌DH5α菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCCM2018031。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术涉及在金黄色葡萄球菌中基于工程化Cas9nickase和胞苷脱氨酶结合的碱基编辑技术形成的pnCasSA-BEC质粒以及相关应用。本专利技术的质粒(1)能够在各种金黄色葡萄球菌菌株中高效快速地进行碱基编辑，其中包括碱基突变和基因失活；(2)能够通过DNA复制机制实现碱基编辑而不会损失转化CFU，获得极高的转化效率。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。本专利技术通过工程化将Cas9nickase和胞嘧啶脱氨酶融合，在金黄色葡萄球菌中开发了高效便利的碱基编辑系统pnCasSA-BEC。pnCasSA-BEC系统可以在不使用修复模板或牺牲转化CFU的情况下实现高效的基因组。通过把相应位点(CAA，CAG，CGA，TGG)编辑成终止密码子(TAA，TAG，TGA，TAA)，此系统能够实现基因失活。除了能快速高效的将基因失活之外，pnCasSA-BEC系统还能够编辑基因组中的其他位点，例如启动子区域和编码小RNA的区域。pnCasSA-BEC系统的未来应用可以显着加速金黄色葡萄球菌的基础科学和应用研究，特别是在低转化效率的菌株中。pnCasSA-BEC系统的开发将为其他微生物的碱基编辑系统开发打下基础。含有pnCasSA-BEC质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.01.15，保藏编号为：CCTCCM2018031。附图说明附图1：编辑质粒pnCasSA-BEC图谱；BsaI位点：用于GoldenGateAssembly技术插入spacer片段；cap1Apromoter：sgRNA表达的启动子；rpsLpromoter：APOBEC1蛋白和Cas9nickase蛋白基因表达的启动子；XTENlinker：APOBEC1蛋白基因和Cas9nickase蛋白基因的连接区域；repF：金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子，用于质粒消除；Cm：金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段；KanR：大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片段；ColE1：大肠杆菌中的质粒复制子。附图2：pnCasSA-BEC在金黄色葡萄球菌中实现高效碱基编辑示意图；图A.采用pnCasSA-BEC系统在金黄色葡萄球菌中进行碱基突变的原理示意图，以及该系统的特点。图B.胞嘧啶脱氨酶的脱氨反应示意图。图C.采用pnCasSA-BEC系统在金黄色葡萄球菌(Newman菌株)中进行碱基突变的测序结果。附图3：pnCasSA-BEC质粒基因失活溶血试验。图A.在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Newman)中使用pnCasS本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种pnCasSA‑BEC质粒，其特征在于，其序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
2018.02.05 CN 20181011449971.一种pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，其序列为SEQIDNO：1。2.一种pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，含有APOBEC1蛋白和Cas9nickase蛋白基因表达的启动子、APOBEC1蛋白基因片段、APOBEC1蛋白基因和Cas9nickase蛋白基因的连接区域以及Cas9nickase蛋白基因片段。3.如权利要求2所述的pnCasSA-BEC质粒，其特征在于，还含有金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子、金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段、大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片...
【专利技术属性】
技术研发人员：季泉江，顾桐年，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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