重组李斯特菌疫苗菌株及其用于癌症免疫疗法的方法技术

本发明专利技术提供治疗、防御人乳头瘤病毒相关肿瘤或癌症以及诱导对人乳头瘤病毒相关肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用表达包含至少一种人乳头瘤病毒抗原的构建体的重组李斯特菌菌株的步骤。

Recombinant Lester strain vaccine and its application in cancer immunotherapy

The present invention provides a method for the treatment, defense of human papillomavirus related tumors or cancer and an induction of an immune response to human papillomavirus related tumors or cancers, the method including the steps of applying a recombinant Lester strain expressing a human papillomavirus antigen to a subject.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组李斯特菌疫苗菌株及其用于癌症免疫疗法的方法
本专利技术提供治疗、防御人乳头瘤病毒相关肿瘤或癌症以及诱导对人乳头瘤病毒相关肿瘤或癌症的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用表达包含至少一种人乳头瘤病毒抗原的构建体的重组李斯特菌菌株的步骤。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HPV)相关口咽癌(HPVOPC)在美国日益流行(从1988年到2004年增加225％)。HPVOPC患者倾向于年轻化并且预后良好，与HPV阴性患者相比，死亡风险低69％。然而，大多数HPVOPC患者都已是晚期，而标准的化疗方案可导致严重的毒性。因此，具有良好预后的患者自相矛盾地处于更高的治疗相关长期不良生活质量结局的风险中。免疫疗法通过逐渐减弱化疗方案而具有降低毒性的潜力，并可能增强长期疾病控制。HR-HPVE6和E7蛋白在发育异常和癌中一致表达，分别破坏细胞周期调控蛋白p53和pRb。发育异常和浸润性恶性病变对E6和E7的强制性表达以及这些蛋白的病毒性来源使得它们成为HPV治疗性疫苗的优异靶标。单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(Lm)是一种食源性革兰氏阳性菌，偶尔会在人类尤其是老年人、新生儿、孕妇和免疫低下个体中导致疾病。除了强烈激活先天免疫并诱导增强抗原呈递细胞(APC)功能的细胞因子应答外，Lm还能够在从吞噬溶酶体逃离后在APC的胞质溶胶中复制，这主要是通过李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的作用。这种独特的胞内生命周期使得由Lm分泌的抗原可在MHCI类和II类分子的背景下加工和呈递，从而导致强效的细胞毒性CD8+和Th1CD4+T细胞介导的免疫应答。本专利技术通过提供包含若干HPV抗原的基于单核细胞增多性李斯特菌的免疫疗法及其用于预防和治疗人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的用途，来满足改善患有HPV相关癌症的患者的治疗模式的需要。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术涉及一种免疫原性组合物，所述组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含重组核酸，所述核酸包含第一开放阅读框，所述第一开放阅读框编码重组多肽，所述重组多肽包含可操作地连接到或融合到至少一种异源性抗原或其片段的LLO蛋白的N末端片段，其中所述重组核酸还包含第二开放阅读框，所述第二开放阅读框编码代谢酶。在另一方面，所述重组李斯特菌包含内源性dal、dat和actA基因的突变、缺失或失活。在又一个方面，本专利技术涉及一种免疫原性组合物，所述组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含重组核酸，所述核酸包含第一开放阅读框，所述第一开放阅读框编码重组多肽，所述重组多肽包含可操作地连接到或融合到四种异源性抗原或其片段的LLO蛋白的N末端片段，其中所述重组核酸还包含第二开放阅读框，所述第二开放阅读框编码代谢酶，并且其中所述四种异源性抗原选自HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7抗原。在另一方面，所述重组李斯特菌包含内源性dal、dat和actA基因的突变、缺失或失活。本专利技术的其他特征和优点将由于以下详细描述的实例和附图而变得显而易见。但是，应当理解，该详细描述和具体实例尽管指出了本专利技术的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本专利技术的精神和范围内的各种变化和修改对阅读了该详细描述的本领域技术人员而言将是显而易见的。附图说明以下附图形成了本说明书的一部分，将它们包括进来以进一步说明本公开的某些方面，通过参考一个或多个这些附图并结合本文提供的对具体实施方案的描述可更好地理解本专利技术。本专利或申请文件包含至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。图1.Lm-E7和Lm-LLO-E7使用不同的表达系统来表达和分泌E7。通过将基因盒引入单核细胞增多性李斯特菌基因组的orfZ域中来产生Lm-E7(A)。hly启动子驱动hly信号序列和LLO的前五个氨基酸(AA)以及随后的HPV-16E7的表达。B)通过以质粒pGG-55转化prfA-菌株XFL-7来产生Lm-LLO-E7。pGG-55具有驱动LLO-E7非溶血性融合体的表达的hly启动子。pGG-55也含有prfA基因，以选择XFL-7在体内对质粒的保留。图2.Lm-E7和Lm-LLO-E7分泌E7。使Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)和10403S(泳道6)在Luria-Bertoni液体培养基中于37℃生长过夜。沉淀相等数目的细菌(通过600nm处吸光度OD确定)，并将18ml的每种上清液进行TCA沉淀。通过Western印迹分析E7表达。用抗E7mAb、随后用HRP-偶联的抗小鼠(Amersham)探测该印迹，接着使用ECL检测试剂显影。图3.LLO-E7融合体的肿瘤免疫抑制功效。显示了肿瘤接种后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米计的肿瘤大小。未暴露的小鼠：空心圆圈；Lm-LLO-E7：实心圆圈；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；和Lm-LLO-NP：实心三角形。图4.来自Lm-LLO-E7-免疫的小鼠的脾细胞在暴露于TC-1细胞时增殖。将C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或对照rLm菌株免疫和强化。在强化后6天收获脾细胞，并以显示的比率与经照射的TC-1细胞一起铺板。将细胞用3H胸苷脉冲处理并收获。将Cpm定义为(实验cpm)-(无TC-1对照)。图5.A.在施用TC-1肿瘤细胞并随后施用Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或无疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中E7特异性的分泌IFN-γ的CD8+T细胞的诱导和浸润肿瘤的数目。B.针对(A)描述的小鼠的脾和肿瘤中E7特异性的CD8+细胞的诱导和浸润。图6.含有PEST区域的李斯特菌构建体在肿瘤中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。A.来自1个实验的代表性数据。B.来自所有3个实验的数据的平均值和SE。图7A.传代对重组李斯特菌疫苗载体的细菌负荷(毒力)的作用。上图：Lm-Gag.下图：Lm-LLO-E7.图7B.传代对脾脏中重组Lm-E7的细菌负荷的作用。描绘了来自四只小鼠的每毫升脾匀浆的平均活细菌CFU。图8显示了在施用经传代的Lm-Gag与未传代的Lm-Gag后对于HIV-Gag和LLO而言的抗原特异性CD8+T细胞的诱导。将小鼠用103个(A、B、E、F)或105个(C、D、G、H)CFU的经传代的李斯特菌疫苗载体免疫，并分析抗原特异性T细胞。B、D、F、H：未传代的李斯特菌疫苗载体。A-D：对MHCI类HIV-Gag肽的免疫应答。E-H：对LLO肽的免疫应答。I：来自用105个CFU经传代的Lm-Gag免疫的小鼠的脾细胞用来自HPVE7的对照肽刺激。图9A显示了在整个LB稳定性研究中的质粒分离。图9B显示了在整个TB稳定性研究中的质粒分离。图9C显示了TB稳定性研究的定量。图10显示了来自在LB中生长的细菌的活细菌氯霉素(CAP)抗性和CAP敏感性集落形成单位(CFU)的数量。深色条：CAP+；白色条：CAP-。每个时间点的两个深色条和两个白色条代表重复样。图11显示了来自在TB中生长的细菌的活细菌CAP抗性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含重组核酸，所述核酸包含第一开放阅读框，所述第一开放阅读框编码重组多肽，所述重组多肽包含可操作地串联连接的四种异源性HPV抗原或其功能性片段，其中所述可操作地连接的异源性HPV抗原或其功能性片段在最N末端异源性抗原的N末端与LLO蛋白的N末端片段融合，其中所述重组核酸还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.14 US 62/241,7121.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含重组核酸，所述核酸包含第一开放阅读框，所述第一开放阅读框编码重组多肽，所述重组多肽包含可操作地串联连接的四种异源性HPV抗原或其功能性片段，其中所述可操作地连接的异源性HPV抗原或其功能性片段在最N末端异源性抗原的N末端与LLO蛋白的N末端片段融合，其中所述重组核酸还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述LLO蛋白的N末端片段包含SEQIDNO:2。3.根据权利要求1至2中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述重组李斯特菌菌株是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述重组多肽由所述重组李斯特菌菌株表达。5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述核酸在所述重组李斯特菌菌株的染色体外质粒中。6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述质粒稳定保持在所述重组李斯特菌菌株中。7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述李斯特菌菌株在基因组dal、dat和actA基因中包含突变、缺失或失活。8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述代谢酶补充所述突变、缺失或失活。9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中由所述第一开放阅读框编码的所述重组多肽的结构包含N末端LLO-抗原1-抗原2-抗原3-抗原4。10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述四种异源性HPV抗原或其功能性片段选自HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7抗原及其片段。11.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中抗原1是HPV16E6，抗原2是HPV16E7，抗原3是HPV18E6，并且抗原4是HPV18E7。12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性组合物，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·珀蒂，K·佩里，
申请(专利权)人：阿德瓦希斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US