一种利用细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种利用细菌靶向投递蛋白的系统，所述系统在沙门氏菌中表达，包括启动子、蛋白分泌信号肽、编码细菌效应蛋白cif的核酸。所述启动子是沙门氏菌三型分泌效应蛋白SopE启动子(PSopE)或乙醇脱氢酶厌氧型启动子(PAdhE)，所述蛋白分泌信号肽是SopE蛋白分泌信号肽。本发明专利技术还提供了所述系统在治疗肿瘤中的用途，特别是在治疗结肠癌中的用途。

A system for using bacterial targeted delivery of therapeutic protein and its application

The invention provides a system for targeting delivery protein by bacteria, which is expressed in Salmonella, including promoters, protein secreting signal peptides, and nucleic acids encoding bacterial effector protein CIF. The promoter is Salmonella three type secretory effector protein SopE promoter (PSopE) or alcohol dehydrogenase anaerobic promoter (PAdhE), and the protein secreting signal peptide is a SopE protein secreting signal peptide. The invention also provides the use of the system in the treatment of tumors, especially in the treatment of colon cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种利用细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其应用
本申请涉及肿瘤靶向治疗
具体来说，本申请涉及细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其在治疗肿瘤中的应用。
技术介绍
近年来，细菌致病机理研究领域的一个重要进展是发现了细菌分泌系统。在革兰氏阴性菌中已经报道了6种分泌系统，细菌的很多分泌蛋白通过不同的机理被输送到细菌外，并与宿主细胞发生直接作用以发挥致病性。许多革兰氏阴性病原菌在感染其宿主(人类)的过程中往往通过三型分泌系统(TypeⅢsecretionsystem,T3SS)将一些毒力因子注入宿主细胞内。这些毒力因子又称为效应蛋白(Effectorprotein)，能够以十分有效的方式干扰宿主细胞的重要信号转导通路如MAPK、NF-κB和泛素化修饰通路等，使其功能紊乱。最先被发现是一种细胞周期抑制因子(Cycleinhibitingfactor,cif)。其中比较重要的一种是革兰氏阴性菌中的三型分泌系统(typeIIIsecretionsystem，T3SS)。T3SS在沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌、大肠杆菌等细菌中都有发现，并与多种细菌病害有关，例如痢疾、鼠疫等等。相关的效应蛋白可以通过T3SS途径从细菌胞质直接进入宿主细胞发挥作用。并且，在医药研究中，通过把相关效应蛋白的信号肽连接到相应疫苗或药物上，也可以直接进行细胞水平的药物治疗。细菌效应蛋白cif(cycleinhibitingfactor)是活性很强的谷氨酰胺脱氨酶。进入宿主细胞后，cif可以与NEDD8分子结合，把NEDD8的40位谷氨酰胺脱氨变成谷氨酸，生成NEDD8-Q40E蛋白，造成细胞分裂周期的紊乱和细胞毒性。Cif脱氨酶活性中重要的氨基酸是第109位半胱氨酸(C)。当把野生型的第109位半胱氨酸(C)变成丙氨酸(A)，即cifC/A突变时，该突变能够消除效应蛋白的脱氨酶活性，使得cif不能再把NEDD8变成NEDD8-Q40E。NEDD8是类泛素蛋白(ULP)，由81个氨基酸组成，通过类泛素化修饰(neddylation)来降解蛋白。类泛素化修饰需要E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶和去NEDD化酶等。类泛素化修饰的典型底物是Cullins，Cullins是Cullin-RINGE3泛素连接酶复合物的组成蛋白。类泛素化修饰的第一步是NEDD8激活酶(NEDD8activatingenzyme，NAE)激活NEDD8；然后活化的NEDD8转移到E2(NEDD8结合酶UBC12)上；第三步，E3(NEDD8连接酶)与E2作用，将NEDD8转移到底物上，然后E3与E2分离，再进行下一个蛋白的降解。类泛素化中有一个E1，即NAE；有两个E2，即UBC12和UBE2F；有多种E3。小分子MLN4924可以抑制NAE，Cif效应蛋白会把NEDD8变成NEDD8-Q40E，都会抑制类泛素化介导的蛋白降解，对细胞造成毒性。但是当把cif效应蛋白用于肿瘤细胞时，抑制类泛素化降解，会造成细胞内大量蛋白(例如p21、p27、CDT1或IκBα)的积聚，造成细胞衰老和凋亡，起到抑制肿瘤增长的左右。最近报道了致病性大肠杆菌来源的cif效应蛋白能够特异抑制宿主细胞CRL泛素连接酶的活性研究发现，cif效应蛋白在结构上具有与木瓜蛋白酶相似的折叠模式和保守的催化位点三联体(Cys-His-Gln)，能够特异对NEDD8分子的第40位谷氨酰氨脱氨修饰，使之变成谷氨酸，受到脱氨化NEDD8分子修饰的CRL泛素连接酶的活性完全受到抑制，因而可导致胞内CRL泛素连接酶底物蛋白(如p27、p21、CDT1、WEE1、RohA和IκBα等)因降解受阻而积聚，诱发一系列细胞病变如应力纤维形成、细胞周期捕获以及细胞凋亡等(CuiJ等，Glutaminedeamidationanddysfunctionofubiquitin/NEDD8inducedbyabacterialeffectorfamily.Science.2010；329(5996):1215-121；JubelinG等，PathogenicbacteriatargetNEDD8-conjugatedcullinstohijackhost-cellsignalingpathways.PLoSPathog.2010；6(9):e1001128；MorikawaH等，ThebacterialeffectorCifinterfereswithSCFubiquitinligasefunctionbyinhibitingdeneddylationofCullin1.BiochemBiophysResCommun.2010；401(2):268-274.)；YaoQ等，AbacterialtypeIIIeffectorfamilyusesthepapain-likehydrolyticactivitytoarrestthehostcellcycle.ProcNatlAcadSciUSA.2009；106(10):3716-3721；和Samba-LouakaA等，TheenteropathogenicEscherichiacolieffectorCifinducesdelayedapoptosisinepithelialcells.InfectImmun.2009；77(12):5471-5477.)利用减毒细菌菌株的肿瘤靶向性定向释放治疗基因已成为肿瘤基因治疗领域的新亮点。鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株是这些菌株中的一个典型代表。VNP20009株的毒性显著减弱。它在小鼠、灵长类动物以及人体I期临床试验中均表现出高度的安全性(LowKB等，LipidAmutantSalmonellawithsuppressedvirulenceandTNFalphainductionretaintumor-targetinginvivo.NatBiotechnol.1999；17(1):37-41和LowKB等，ConstructionofVNP20009:anovel,geneticallystableantibiotic-sensitivestrainoftumor-targetingSalmonellaforparenteraladministrationinhumans.MethodsMolMed.2004；90:47-60)。沙门氏菌有两个T3SS，SPI1主要在细菌被宿主细胞内吞前发挥作用，SPI2在细菌的胞内寄生过程中发挥作用。鸟苷酸交换因子可以帮助活化Ras蛋白。SOPE2是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的鸟苷酸交换因子。但据专利技术人所知，目前还没有通过鼠伤寒沙门氏菌将治疗性蛋白靶向地递送到肿瘤细胞内的报道。为此，本领域迫切需要提供一种利用细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其应用。
技术实现思路
针对现有技术中的缺点，本申请采用具有高度肿瘤靶向性和安全性的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株为载体，通过乙醇脱氢酶厌氧型启动子调控SPI-1三型分泌系统效应蛋白分泌信号肽与cif效应蛋白的融合表达,以实现cif效应蛋白从胞外到胞内的定向递送。为了解决上述技术问题，本专利技术提供下述技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用细菌靶向投递蛋白的系统，其特征在于，所述系统包括启动子、蛋白分泌信号肽、编码蛋白的核酸，所述系统在细菌中表达所述蛋白，所述蛋白分泌信号肽时介导所述蛋白进入细胞的信号肽。

【技术特征摘要】
1.一种利用细菌靶向投递蛋白的系统，其特征在于，所述系统包括启动子、蛋白分泌信号肽、编码蛋白的核酸，所述系统在细菌中表达所述蛋白，所述蛋白分泌信号肽时介导所述蛋白进入细胞的信号肽。2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统是四环素诱导表达系统。3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述细菌是革兰氏阴性菌。4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是沙门氏菌。5.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述沙门氏菌是沙门...

【专利技术属性】
技术研发人员：何新红，刘梁，倪建佼，李文涛，王英，韦栋平，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海,31