一种表达重组人NLK基因的质粒及构建方法技术

本发明专利技术的目的在于针对NLK基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种表达重组人NLK基因的质粒及构建方法，其通过设计能特异性克隆人NLK基因的引物并在其上游添加限制性内切酶识别序列及保护性碱基；用PCR反应合成该含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列；将含有限制性内切酶识别序列的人NLK基因序列与pcDNA3.0载体分别进行双酶切反应；用T4 DNA连接酶将双酶切后的人NLK基因序列与双酶切后的pcDNA3.0载体进行连接，形成重组质粒；将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和测序验证，挑选出正确克隆的重组菌液；提取正确克隆的重组菌液中的质粒；用Western blot验证上一步中重组质粒于细胞内NLK蛋白的表达情况。

A plasmid expressing recombinant human NLK gene and its construction method

The aim of the invention is to research status of NLK gene in tumor and its application as a potential therapeutic target, providing a plasmid expressing recombinant human NLK gene and its construction method, through design specific primers to clone human NLK gene and add restriction endonuclease recognition sequences and protective bases in the upstream; human NLK gene sequence containing the restriction enzyme recognition sequence and protective bases were synthesized with PCR reaction; containing human NLK gene sequence and pcDNA3.0 vector restriction endonuclease recognition sequences were digested with T4 reaction; DNA ligase pcDNA3.0 vector of human NLK gene sequences were digested with after double digestion of recombinant plasmid formation; the recombinant plasmid competent cell transformation, training, screening and sequencing, the recombinant E.coli correctly selected clones Extraction; recombinant plasmid cloned in bacteria; Western blot verification on the restructuring step in cell NLK expression plasmid protein.

【技术实现步骤摘要】
一种表达重组人NLK基因的质粒及构建方法
本专利技术属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种蛋白激酶Nemo样激酶基因NLK及其重组质粒的构建方法。
技术介绍
Nemo样激酶(Nemo-likekinase,NLK)是一进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，于1998年被克隆，与黑腹果蝇的nmo属同源物，其编码基因定位于17q11.2，编码大小约58.3KD的丝氨酸/苏氨酸激酶。最初的研究认为NLK与爪蟾、果蝇、线虫等模式生物的发育相关，在人体的研究发现，NLK参与神经生长因子(NGF)诱导的神经外生性生长；NLK通过抑制Wnt通路抑制造骨新生；同时也参与依托泊苷诱导的精细胞凋亡，以上研究证实NLK在生物体内参与多项生命活动。在肿瘤中的研究发现，NLK参与多条细胞内信号传导通路，NLK的表达异常与肿瘤的发生、发展、预后密切相关。在结肠癌中的研究发现，NLK参与Wnt通路的调控，Wnt信号通路是一条进化保守的信号传导通路，大量研究显示Wnt不仅在胚胎发育中起重要作用，而且与多种肿瘤的发生发展密切相关。目前认为经典Wnt通路的组成包括：细胞外因子、跨膜受体、胞质蛋白及核内转录因子等一系列蛋白，Wnt与frizzled结合后促使β-catenin由细胞质向细胞核移位，并在细胞核中与转录因子TCF/LEF共同作用激活c-myc、CyclinD1、MDR1、PPAR-δ等靶基因的转录。MAP3K家族中的TAK1被认为是NLK的上游活化蛋白，非经典Wnt5a-Ca2+信号可以作为TAK1/NLK上游的活化信号，活化的NLK通过磷酸化TCF而抑制β-catenin/TCF复合物的转录活性从而抑制经典的Wnt/β-catenin信号，使细胞周期停滞在G1期。在进一步的研究中发现，NLK能够通过磷酸化转录共激活因子CBP/P300的C-末端区域而影响NF-kB、AP-1、Smad等转录因子活性发挥生物学功能。在前列腺癌的研究中发现，雄激素受体(AndrogenReceptor,AR)表达阳性的人前列腺癌细胞中诱导NLK的表达可以促使细胞凋亡。在进一步的研究中发现，NLK不仅能够与AR形成复合物抑制AR对靶基因的转录活性，而且在转录水平抑制ARmRNA的表达；在乳腺癌中，NLK促进c-Myb降解，抑制肿瘤细胞增殖，并诱导凋亡。然而另一项研究却发现，在人肝癌细胞系中敲低NLK的表达能够抑制肿瘤细胞的生长，同时实验结果显示，敲除NLK后细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK2的表达也明显降低，细胞周期发生G1/S阻滞。与之相同的是，在人口腔腺癌细胞CAL27中敲低NLK能够显著抑制肿瘤细胞增殖；在胆囊癌中，NLK敲低后细胞增殖和转移能力明显降低。尤其值得关注的是，NLK低表达的卵巢癌患者的生存期较短，且在卵巢癌中提高NLK的表达可增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，但是在喉癌的研究中却发现NLK敲低后喉癌细胞Hep-2对紫杉醇的敏感性增加，且细胞增殖能力降低。我们前期研究也发现，NLK可能作为二甲双胍的潜在靶基因，二甲双胍处理或敲减NLK均能抑制肺癌细胞增殖及干性表型等。由此可见，NLK在不同组织来源的肿瘤中发挥不同的生物学功能。越来越多的研究表明，NLK在肿瘤等疾病中发挥重要作用，可能是肿瘤治疗的潜在靶标，使NLK成为目前研究热点之一，而对于NLK基因功能及其机制的研究，迫切需要利用基因工程构建其过表达质粒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对NLK基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种表达重组人NLK基因的质粒及构建方法。一种表达重组人NLK基因的质粒的构建方法，其包括如下步骤：S1,设计能特异性克隆人NLK基因的引物并在其上游添加限制性内切酶识别序列及保护性碱基，化学合成该引物；S2，用PCR反应合成该含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列；S3，将含有限制性内切酶识别序列的人NLK基因序列与pcDNA3.0载体分别进行双酶切反应；S4,用T4DNA连接酶将双酶切后的人NLK基因序列与双酶切后的pcDNA3.0载体进行连接，形成重组质粒；S5，将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和测序验证，挑选出正确克隆的重组菌液；S6，提取正确克隆的重组菌液中的质粒；S7,用Westernblot验证上一步中重组质粒于细胞内NLK蛋白的表达情况。优选的，所述的步骤S1中包含如下步骤：(1)利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人NLK基因的编码(CDS)区序列(213-1796)，并标记其起始密码子编码序列(ATG)和终止密码子编码序列(TGA)。(2)选取包含CDS区的一段碱基序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，所设计引物除满足引物设计原则外，其PCR产物应包括全长CDS区序列，本专利技术所设计的引物从左到右是5’-末端至3’-末端的方向，所述的引物如下表所示：序列名称5’——3’序列1正义链GCTTGACCCAGTTTGCTTTC序列2反义链ATTATCTTCCACCATCACTCCC(3)根据pcDNA3.0质粒图谱，排除与NLKCDS区序列重叠限制性内切酶位点，选择合适的限制性内切酶(HindIII和Xhol)，分别于引物正义链5’端加上保护性碱基和HindIII限制性内切酶识别序列、引物反义链5’端加上保护性碱基和Xhol限制性内切酶识别序列，含有保护性碱基及限制性内切酶识别序列的引物如下表所示：序列名称5’——3’序列3正义链CCCAAGCTTGGGGCTTGACCCAGTTTGCTTTC序列4反义链CCGCTCGAGCGGATTATCTTCCACCATCACTCCC优选的，所述的步骤S2中包含如下步骤：(1)取处于对数期的SPC-A-1细胞(人肺腺癌细胞)，用Trizol裂解法提取总RNA；(2)用PCR反应合成含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列：反应体系如下：2×MasterMix12.5μl上游引物1μl下游引物1μlcDNA1μlddH2O9.5μlTotal25μl反应条件：95℃预变性2min；95℃30s、60℃2min、72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，产物进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。(3)按照(2)的体系，大量PCR300ul含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的反应产物(人NLK基因)。(4)将300ulPCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后于紫外光下切取目的条带，目的条带为含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。(5)将胶回收产物用DNA纯化试剂盒进行纯化。优选的，所述的步骤S3中包含如下步骤：(1)将纯化后的PCR产物和pcDNA3.0载体分别用HindIII限制性内切酶和Xhol限制性内切酶进行双酶切，反应体系如下：反应条件：37℃水浴酶切过夜。(2)用DNA纯化试剂盒对上述分别经过双酶切的PCR产物和pcDNA3.0载体进行纯化。优选的，所述的步骤S4中，用T4DNA连接酶将双酶切后的人NLK基因序列与双酶切后的pcDNA3.0载体进行连接，形成重组质粒，反应条件为16℃连接过夜。优选的，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达重组人NLK基因的质粒的构建方法，其包括如下步骤：S1，设计能特异性克隆人NLK基因的引物并在其上游添加限制性内切酶识别序列及保护性碱基，化学合成该引物；S2，用PCR反应合成S1中含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列；S3，将纯化后的含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列与pcDNA3.0载体分别进行双酶切反应；S4，用T4DNA连接酶将双酶切后的人NLK基因序列与双酶切后的pcDNA3.0载体进行连接，形成重组质粒；S5，将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和验证，挑选出正确克隆的重组菌液；S6，提取正确克隆的重组菌液中的质粒；S7，用Western blot验证上一步中重组质粒于细胞内NLK蛋白的表达情况。

【技术特征摘要】
1.一种表达重组人NLK基因的质粒的构建方法，其包括如下步骤：S1，设计能特异性克隆人NLK基因的引物并在其上游添加限制性内切酶识别序列及保护性碱基，化学合成该引物；S2，用PCR反应合成S1中含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列；S3，将纯化后的含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列与pcDNA3.0载体分别进行双酶切反应；S4，用T4DNA连接酶将双酶切后的人NLK基因序列与双酶切后的pcDNA3.0载体进行连接，形成重组质粒；S5，将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和验证，挑选出正确克隆的重组菌液；S6，提取正确克隆的重组菌液中的质粒；S7，用Westernblot验证上一步中重组质粒于细胞内NLK蛋白的表达情况。2.如权利要求1所述的表达重组人NLK基因的质粒的构建方法，其特征在于：所述的步骤S1中包含如下步骤：(1)利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人NLK基因的编码(CDS)区序列(213-1796)，并标记其起始密码子编码序列(ATG)和终止密码子编码序列(TGA)；(2)选取包含CDS区的一段碱基序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，核苷酸序列从左到右是5’-末端至3’-末端的方向，所设计的引物为：序列1：正义链GCTTGACCCAGTTTGCTTTC序列2：反义链ATTATCTTCCACCATCACTCCC(3)根据pcDNA3.0质粒图谱，排除与NLKCDS区序列重叠限制性内切酶位点，选择合适的限制性内切酶(HindIII和XhoI)，分别于引物正义链5’端加上保护性碱基和HindIII限制性内切酶识别序列、引物反义链5’端加上保护性碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋鑫，付桥粉，孟旭东，李乔林，田慧，
申请(专利权)人：信雅生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32