黑色素瘤致死率高，深入探索其发病机制，并进一步研发抑制黑色素瘤细胞增殖、侵袭等恶性行为的新治疗靶点，可为黑色素瘤临床治疗提供更充分的实验室依据。本发明专利技术的目的是，提出上皮鳞状表型相关抑制子(Lympho‑Epithelial Kazal‑type related inhibitor，LEKTI)编码基因SPINK5干扰片段的构建及其在黑色素瘤细胞增殖、侵袭方面的应用，可为黑色素瘤的基础研究及临床治疗靶点研发提供新的实验证据。其中所述的SPINK5全称为：丝氨酸肽酶抑制因子Kazal型5(Serine Peptidase InhibitorKazal Type 5,SPINK5)。
Construction method and application of recombinant plasmid for human SPINK5 gene
The high mortality rate of melanoma, deep exploration of its pathogenesis, and further research and development of melanoma cell proliferation, invasion and other malignant behavior of the new therapeutic targets, can provide a more sufficient laboratory basis for the clinical treatment of melanoma. The purpose of the present invention is to propose the construction of the Lympho Epithelial Kazal type related inhibitor, LEKTI) encoding gene SPINK5 interference fragment and its application in the proliferation and invasion of melanoma cells, which can provide a new basis for the basic research of melanoma and the development of clinical therapeutic targets. Experimental evidence. The SPINNK5 described above is called: Serine Peptidase Inhibitor Kazal Type 5 (SPINK5).
【技术实现步骤摘要】
重组人SPINK5基因的质粒的构建方法及其应用
本专利技术属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种上皮鳞状表型相关抑制蛋白基因SPINK5重组质粒的构建方法及其应用。
技术介绍
恶性黑色素瘤死亡率高，放化疗不敏感，晚期患者5年生存率低于5％。我国黑色素瘤发病率及死亡率逐年上升，且发病年龄呈年轻化趋势。尽管分子靶向治疗药物的出现为黑色素瘤临床治疗带来突破性进展，但令人遗憾的是，CTLA-4单抗、PD-1单抗、BRAF抑制剂和MEK抑制剂等多种靶向治疗药物均未在国内上市，且价格高昂，耐药率高。因此，寻找黑色素瘤新的治疗靶点尤为重要。SPINK5又名淋巴上皮鳞状表型相关抑制子(Lympho-EpithelialKazal-typerelatedinhibitor，LEKTI)，位于染色体5q33.1，编码分泌型丝氨酸蛋白酶抑制剂LEKTI，参与皮肤脱皮、炎症等生理病理过程，在维持皮肤正常微环境中发挥重要作用。SPINK5基因突变是先天性Netherton综合征的主要病因。然而SPINK5在皮肤黑色素瘤中的作用尚不明确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对SPINK5基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种表达重组人SPINK5基因的质粒及构建方法。一种表达重组人SPINK5基因的质粒的构建方法，其包括如下步骤：S1，从GenBank中查询SPINK5基因以及上下游的序列，设计引物。S2，使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因S3，用限制性内切酶分别对含有SPINK5基因的质粒和表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro(H102)载体(CutSmart)进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，回收胶S4，用T4DNA连接酶将双酶切后的人SPINK5基因序列与双酶切后的pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体进行连接，形成重组质粒；S5，将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和测序验证，挑选出正确克隆的重组菌液；S6，提取正确克隆的重组菌液中的质粒；S7,用Westernblot验证上一步中重组质粒于细胞内SPINK5蛋白的表达情况。S8，免疫组化检测SPINK5编码蛋白在恶性黑色素瘤组织及良性色素痣组织中表达情况；S9,MTS细胞增殖实验检测在恶性黑色素瘤细胞中利用重组质粒导入SPINK5后黑色素瘤细胞增殖能力；S10,Transwell细胞迁移试验检测在恶性黑色素瘤细胞中利用重组质粒导入SPINK5后黑色素瘤细胞迁移能力。优选的，所述的步骤S1中包含如下步骤：(1)利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人SPINK5基因的编码(CDS)区序列(1-1064)，并标记其起始密码子编码序列(ATG)和终止密码子编码序列(TGA)。(2)选取包含CDS区的一段碱基序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，所设计引物除满足引物设计原则外，其PCR产物应包括全长CDS区序列，本专利技术所设计的引物从左到右是5’-末端至3’-末端的方向，所述的引物如下表所示：优选的，所述的步骤S2中包含如下步骤：(1)取处于对数期的A2058细胞(人黑色素瘤细胞)，用Trizol裂解法提取总RNA；(2)用PCR反应合成含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人SPINK5基因序列；(3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用然后用胶回收试剂盒进行胶回收。优选的，所述的步骤S3中包含如下步骤：(1)将纯化后的PCR产物和表达载体分别用HindIII限制性内切酶和Xhol限制性内切酶进行双酶切，反应体系如下：DNA25μl10×Hbuffer5μl0.1％BSA5μlHindIII2.5μlXhol2.5μlddH2O10μlTotal50μl反应条件：37℃水浴酶切过夜。(2)用DNA纯化试剂盒对上述分别经过双酶切的PCR产物和表达载体体进行纯化。优选的，所述的步骤S4中，用T4DNA连接酶将双酶切后的人SPINK5基因序列与双酶切后的表达载体进行连接，形成重组质粒，反应条件为16℃连接过夜。优选的，所述的步骤S5中包含如下步骤：(1)重组质粒的转化：将步骤S4中的10μl连接反应液加入150μl感受态细胞中，轻微混匀，冰上放置30min后，42℃水浴90s，冰水孵育2min。加入1mlLB培养基，置于37℃摇床振荡(100rpm)培养1h。4000rpm离心2min，去上清，加入150μl含有氨苄青霉素的LB培养基，轻微混匀，将其均匀涂布于含有氨苄青霉素的细菌培养平板上，37℃倒置培养15h。(2)挑选单克隆菌落，置于1ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡(230rpm)培养7h，取1μl菌液用能特异扩增SPINK5基因的引物进行PCR反应，并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。(3)取部分上一步中鉴定出的阳性菌液进行测序，将测序结果与SPINK5基因序列进行比对，若序列一致，则该菌液即为正确克隆的菌液。优选的，所述的步骤S6中提取质粒的步骤如下：将测序正确的菌液接种于15ml含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃摇床振荡(230rpm)培养过夜，用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书进行质粒抽提。优选的，所述的步骤S7中，用Westernblot验证上一步中重组质粒于细胞内SPINK5编码蛋白的表达情况时，用载体质粒作为阴性对照，内参蛋白为α-Tubulin。优选的，如上所述的引物序列，经如上所述的表达重组人SPINK5基因的质粒的构建方法，可以PCR扩增出人SPINK5基因编码区序列，扩增出的人SPINK5基因编码区序列包含上述引物序列。优选的，如上所述的引物序列，经如上所述的表达重组人SPINK5基因的质粒的构建方法，可以扩增出含有SPINK5基因的表达载体、重组质粒、宿主菌和转基因细胞系。本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术公开了一种能特异性克隆人SPINK5基因的引物序列；2.本专利技术公开了一种编码人SPINK5蛋白的重组质粒的构建方法；3.本专利技术构建的重组质粒(菌液)可批量扩增，满足SPINK5基因相关多个分子生物学研究；4.用该重组质粒转染人黑色素瘤细胞系，Westernblot检测发现，人黑色素瘤细胞系中SPINK5蛋白表达增加，表明本专利技术所构建的重组质粒能特异表达人SPINK5蛋白。5.用该重组质粒研究发现，SPINK5参与黑色素瘤细胞增殖与迁移功能的调控。附图说明图1为构建SPINK5基因重组质粒的载体结构图；图2为人SPINK5重组质粒测序图(部分截图)；图3为SPINK5重组质粒转染黑色素瘤细胞后人SPINK5蛋白的表达情况图。图4为云南省肿瘤医院肿瘤人黑色素瘤组织中及良性色素痣组织样本SPINK5表达情况图：如图所示SPINK5在人黑色素瘤组织中较良性色素痣低表达。图5为NCBI基因表达数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)中，SPINK5在人黑色素瘤原位癌和转移癌中的表达情况。如图本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达重组人SPINK5基因的质粒的构建方法，其特征在于：所设计引物如下：正义链为：CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGAAGATA GCCACAGTGTCAG，反义链为：TCATCCTTGTAGTCGGATCCTTCGTCAGA CGGGGGCAT。
【技术特征摘要】
1.一种表达重组人SPINK5基因的质粒的构建方法，其特征在于：所设计引物如下：正义链为：CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGAAGATAGCCACAGTGTCAG，反义链为：TCATCCT...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋鑫，李真，董苏伟，孟旭东，胡红艳，
申请(专利权)人：信雅生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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