一种沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用技术

本发明专利技术的目的是提供一种在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用。采用本发明专利技术的方法构建的慢病毒LV‑shWSB2具有使WSB2基因沉默效果，且能低表达WSB2蛋白，低表达WSB2蛋白能够抑制人黑色素瘤细胞A375的增殖。

Construction and application of a lentivirus silencing WSB2 protein

The aim of the present invention is to provide a method for constructing lentiviruses silently expressing WSB2 protein in human melanoma cells and its application. The lentivirus LV shWSB2 constructed by the method of the invention has the effect of silencing WSB2 gene, and can lower the expression of WSB2 protein, and the low expression of WSB2 protein can inhibit the proliferation of human melanoma cell A375.

【技术实现步骤摘要】
一种沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用。
技术介绍
黑色素瘤(melanoma)恶性程度高，对放化疗均不敏感。全球发病率及死亡率逐年上升，且呈年轻化趋势，提示其原因可能与某些内在致病基因相关并发挥重要作用。令人遗憾的是：黑色素瘤发病机理长期未获得突破性进展。因此，深入开展针对性的基因筛查研究有望为黑色素瘤防治提供新的干预策略。最新研究表明，WSB2(WDrepeatandSOCSboxcontaining2)蛋白分子量为45.3KDa，定位于细胞质及细胞核，是WD重复蛋白(wd-repeatprotein)亚家族的成员。其蛋白结构中含5个WD重复序列和在C末端的SOCS框(Suppressorofcytokinesignalingbox)。WD重复蛋白直接与泛素连接酶E3(E3UbiquitinLigases)结合，SOCS框与泛素化底物结合，充当E3酶与泛素化底物结合的桥梁。由于特殊蛋白结构，WSB2蛋白具有泛素连接酶的作用，可能与肿瘤发生密切相关。目前为止，尚无一种在黑色素瘤组织中特异性高表达的基因，因此探寻新的黑色素瘤组织相对特异高表达的基因，从分子、细胞、动物、临床组织四个方面阐明其在黑色素瘤的发生、发展变化中的复杂分子调控作用机理及其有关信号转导过程与机制，不仅有重要的分子/细胞生物学意义，而且对黑色素瘤的早期基因诊断及精准治疗，均具有重大临床应用价值和社会效应，有望取得新的突破。因此，为诊断和治疗目的，研究和开发在黑色素瘤中高表达的基因和/或蛋白具有重大理论和现实意义。本领域迫切需要研究新的黑色素瘤组织高表达基因和/或蛋白，目前尚无WSB2在黑色素瘤中的研究报道。
技术实现思路
本专利技术涉及构建在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒，其特征在于：包含特异性靶向序列1“CTTCGAAGTTTCCTAACAA”、序列2“CGGCTTCTTACGATACCAA”、序列3“AGACACTATTACTGGCTTT”，可用于特异性沉默WSB2基因表达。另外，本专利技术还涉及构建在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的方法，其包括如下步骤：一、慢病毒LV-WSB2的构建。1.利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人WSB2基因的编码(CDS)区序列：ATGCGGGTAGACAGGGAGAGCAGGTTTCTCAGGGGGACGGGGACAGGCGAGGCTGTCGCCGTAGAGGAACCGCTGCTGCTGGCCGAACTCAAGCCCGGGCGCCCCCACCAGTTTGATTGGAAGTCCAGCTGTGAAACCTGGAGCGTCGCCTTCTCCCCAGATGGCTCCTGGTTTGCTTGGTCTCAAGGACACTGCATCGTCAAACTGATCCCCTGGCCGTTGGAGGAGCAGTTCATCCCTAAAGGGTTTGAAGCCAAAAGCCGAAGTAGCAAAAATGAGACGAAAGGGCGGGGCAGCCCAAAAGAGAAGACGCTGGACTGTGGTCAGATTGTCTGGGGGCTGGCCTTCAGCCCGTGGCCTTCCCCACCCAGCAGGAAGCTCTGGGCACGCCACCACCCCCAAGTGCCCGATGTCTCTTGCCTGGTTCTTGCTACGGGACTCAACGATGGGCAGATCAAGATCTGGGAGGTGCAGACAGGGCTCCTGCTTTTGAATCTTTCCGGCCACCAAGATGTCGTGAGAGATCTGAGCTTCACACCCAGTGGCAGTTTGATTTTGGTCTCCGCGTCACGGGATAAGACTCTTCGCATCTGGGACCTGAATAAACACGGTAAACAGATTCAAGTGTTATCGGGCCACCTGCAGTGGGTTTACTGCTGTTCCATCTCCCCAGACTGCAGCATGCTGTGCTCTGCAGCTGGAGAGAAGTCGGTCTTTCTATGGAGCATGAGGTCCTACACGTTAATTCGGAAGCTAGAGGGCCATCAAAGCAGTGTTGTCTCTTGTGACTTCTCCCCCGACTCTGCCCTGCTTGTCACGGCTTCTTACGATACCAATGTGATTATGTGGGACCCCTACACCGGCGAAAGGCTGAGGTCACTCCACCACACCCAGGTTGACCCCGCCATGGATGACAGTGACGTCCACATTAGCTCACTGAGATCTGTGTGCTTCTCTCCAGAAGGCTTGTACCTTGCCACGGTGGCAGATGACAGACTCCTCAGGATCTGGGCCCTGGAACTGAAAACTCCCATTGCATTTGCTCCTATGACCAATGGGCTTTGCTGCACATTTTTTCCACATGGTGGAGTCATTGCCACAGGGACAAGAGATGGCCACGTCCAGTTCTGGACAGCTCCTAGGGTCCTGTCCTCACTGAAGCACTTATGCCGGAAAGCCCTTCGAAGTTTCCTAACAACTTACCAAGTCCTAGCACTGCCAATCCCCAAGAAAATGAAAGAGTTCCTCACATACAGGACTTTTTAA2.合成RNAi的DNA模板序列WSB2-RNAi-1：正义链：CTTCGAAGTTTCCTAACAA反义链：GAAGCTTGCCCGGATTGTTWSB2-RNAi-2：正义链：CGGCTTCTTACGATACCAA反义链：GCCGAAGAATGCTATGGTTWSB2-RNAi-3：正义链：AGACACTATTACTGGCTTT反义链：TCTGTGATAATGACCGAAA3.模板链退火取上链模板与等量下链模板1、2、3、4分别混合，95℃水浴5min，自然冷却至室温退火。(模板链浓度20μmol/L，退火后双链DNA为10μmol/L)4.siRNA-WSB2合成siRNA合成体系双链DNA模板20μlT7RNA聚合酶5μl5×RNA合成缓冲液10μlNTP混合液2μlRNase抑制剂1μlDEPC处理水12μl混匀后离心200rpm，1min，置入37℃温箱孵育过夜。5.RNAi分离及纯化(1)将上述RNA反应液加入DNaseI2U。(2)混匀后37℃孵育40min。(3)向上述液体加入等体积酚：氯仿，混匀。(4)4℃、18000rpm离心20min，分离有机/水相。水相移入一新eppendorf管。(5)加入1/10体积3.0mol/L乙酸钠，混匀。(6)加入2备体积预冷乙醇。混匀，冰浴2h，4℃、18000rpm离心50min。(7)去除上清液，加入1/2体积70％乙醇。(8)4℃、18000rpm离心20min，去上清，室温干燥。(9)向上述沉淀加入50μlDEPC处理水，即为含RNA溶液。6.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的方法，其特征在于：合成RNAi的DNA模板序列WSB2‑RNAi‑1：正义链：CTTCGAAGTTTCCTAACAA反义链：GAAGCTTGCCCGGATTGTTWSB2‑RNAi‑2：正义链：CGGCTTCTTACGATACCAA反义链：GCCGAAGAATGCTATGGTTWSB2‑RNAi‑3：正义链：AGACACTATTACTGGCTTT反义链：TCTGTGATAATGACCGAAA

【技术特征摘要】
1.一种构建在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的方法，其特征在于：合成RNAi的DNA模板序列WSB2-RNAi-1：正义链：CTTCGAAGTTTCCTAACAA反义链：GAAGCTTGCCCGGATTGTTWSB2-RNAi-2：正义链：CGGCTTCTTACGATACCAA反义链：GCCGAAGAATGCTATGGTTWSB2-RNAi-3：正义链：AGACACTATTACTGGCTTT反义链：TCTGTGATAATGACCGAAA2.用权利要求1的方法构建的沉默表达WSB2基因的慢病毒，包括LV-shWSB2-1、LV-shWSB2-2、LV-shWSB2-3。3.用权利要求1的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋鑫，张一，李真，孟旭东，
申请(专利权)人：信雅生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32