本发明专利技术公开了一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用。本发明专利技术首先公开了一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS‑1株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.16820。本发明专利技术进一步公开了所述重组杆状病毒ChS‑1株在制备预防猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。本发明专利技术还公开了一种猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，包括：增殖重组杆状病毒ChS‑1株，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，收获抗原液；将抗原液灭活后与佐剂混合，乳化，即得。本发明专利技术所述重组杆状病毒ChS‑1株的Cap蛋白表达量高、病毒滴度高，所制备灭活疫苗的安全性及免疫效果好，能够用于猪圆环病毒3型的防控。
【技术实现步骤摘要】
表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用
本专利技术涉及一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒，还涉及所述重组杆状病毒在制备预防猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用，属于表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建领域。
技术介绍
猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种小而无囊膜、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。目前，PCV可分为3个基因型，即PCV-1、PCV-2和PCV3。PCV-1为非致病性PCV，PCV-2和PCV-3均对猪有致病性，可引起PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合征)，又称PMWS相关PCV。PCV-3是由Palinski等从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定，其基因组长2.0kb，随后世界上许多国家和地区都有该病的报道，中国学者对国内部分省区的PCV-3流行情况进行了调查，湛洋等对江苏、湖南、湖北疑似猪皮炎肾炎综合征的病猪组织样品进行PCV-3巢式PCR检测，结果在这些病料中检测到PCV-3的存在；贺会利等从广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV-3；刘晓东等对中国10个省区106份样品进行PCR检测，结果表明安徽、江西、山东、福建、河南和广西存在PCV-3阳性猪场，给中国的养猪业造成严重的经济损失。目前，中国国内尚无猪圆环病毒3型疫苗。由于该病传播流行的快速以及其较高的致病性，应当引起养殖户以及兽医防控机构的高度重视，需要尽早开展针对该病研究。同时结合对PCV-2防控的成功经验，疫苗研制，尤其是新型的猪圆环病毒3型疫苗的研制，已是当务之急。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株；本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供所述表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株在制备预防或治疗猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术从吉林、河北和山东疑似猪圆环病毒发病的病料中提取PCV3毒株DNA，然后用特异性引物分别扩增Cap蛋白基因(ORF2)，连接至载体pOET1构建获得重组质粒pOET1-ORF2-ChS-1、pOET1-ORF2-HaD-1和pOET1-ORF2-RiZ-1。本专利技术进一步将昆虫病毒DNA(flashBACPrime)与转移质粒(pOET1-ORF2-ChS-1、pOET1-ORF2-HaD-1和pOET1-ORF2-RiZ-1)分别共转染Sf9昆虫细胞，获得3株PCV3重组杆状病毒，分别命名为ChS-1株、HaD-1株和RiZ-1株。本专利技术对三株重组杆状病毒进行病毒滴度和表达量的测定，结果表明ChS-1株的病毒滴度达到8.2×107pfu/ml，120小时上清中Cap蛋白含量达58.56μg/ml。ChS-1株在病毒含量及Cap蛋白表达量上均明显优于其他两个毒株。本专利技术获得的重组杆状病毒ChS-1株，其ORF2基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术将获得的Cap蛋白表达量高、病毒效价良好的表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.16820；分类命名为：表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的杆状病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2018年11月28日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术对重组杆状病毒ChS-1株用特异性引物进行PCR鉴定，结果为阳性。本专利技术对重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白的鉴定结果表明，重组杆状病毒ChS-1株表达的PCV3Cap蛋白分子量与预期一致；表达的PCV3ORF2蛋白能够形成病毒样粒子，大小约为17nm，与真正的PCV3病毒形态大小相似，证明表达的PCV3衣壳蛋白能够正确的形成病毒样颗粒。本专利技术进一步公开了所述的重组杆状病毒ChS-1株在制备预防或治疗猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。本专利技术进一步公开了一种预防猪圆环病毒3型的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的重组杆状病毒ChS-1株以及药学上可接受的佐剂或载体。本专利技术还公开了一种猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)增殖所述的重组杆状病毒ChS-1株，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，收获抗原液；(2)将抗原液加入灭活剂进行灭活，灭活后抗原液与佐剂混合，乳化，即得。其中，步骤(1)将所述的重组杆状病毒ChS-1株接种昆虫细胞进行增殖，收取病变细胞，冻融，离心，取上清液，得到抗原液。步骤(1)所述昆虫细胞为Sf9或Highfive昆虫细胞；采用转瓶培养或生物反应器悬浮培养昆虫细胞，待细胞密度达到1.5-2.0×106.0cells/ml时进行病毒接种；所述接种为按MOI为1.0的接种量进行接种；接种后以110-130r/min27℃培养96-120h，当80％以上细胞病变时收获培养物。所述抗原液中猪圆环病毒3型Cap蛋白的浓度≥10μg/ml。步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)溶液；优选的，所述灭活剂的终浓度为5.0mM。所述灭活的条件为：在pH7.8±0.2，37℃灭活24小时，然后加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液终止灭活。按体积比计，步骤(2)灭活后抗原液：佐剂＝9：1；优选的，所述佐剂为MontanideISA15AVG佐剂。步骤(2)所述乳化的方法具体为：先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，即制备成猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗。最终疫苗抗原含量应≥10μg/ml。本专利技术还公开了所述的制备方法制备得到的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗。安全检验结果表明，本专利技术猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的安全性良好，接种疫苗的小鼠全部健活，且没有出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。效力检验结果表明，本专利技术所制备的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗能诱导小鼠产生高效价PCV3抗体。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术构建获得了一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株，该重组杆状病毒的Cap蛋白表达量高，且病毒滴度高。本专利技术利用重组杆状病毒ChS-1株制备的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗，安全性良好，免疫小鼠的PCV3血清抗体效价高，疫苗的免疫效果良好，是一种安全、有效的重组杆状病毒亚单位疫苗，能够用于猪圆环病毒3型的防控。附图说明图1为实施例1中穿梭载体pOET1示意图；图2为实施例2中PCV3ORF2PCR鉴定结果图；图3为实施例1中PCV3ORF2目的蛋白Western-blot结果分析图；其中M为Marker，1为空白对照，2为PCV3ORF2目的蛋白；图4为实施例2中重组杆状病毒表达PCV3ORF2蛋白电镜负染图；图5为猪圆环病毒3型Cap蛋白灭活疫苗免疫小鼠的血清抗体。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS‑1株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.16820。
【技术特征摘要】
1.一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.16820。2.按照权利要求1所述的重组杆状病毒ChS-1株，其特征在于，其ORF2基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述的重组杆状病毒ChS-1株在制备预防或治疗猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。4.一种预防猪圆环病毒3型的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的灭活的权利要求1或2所述重组杆状病毒ChS-1株以及药学上可接受的佐剂或载体。5.一种猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)增殖权利要求1或2所述的重组杆状病毒ChS-1株，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，收获抗原液；(2)将抗原液加入灭活剂进行灭活，灭活后抗原液与佐剂混合，乳化，即得。6.按照权利要求5所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张智明，柴华，梁宛楠，孙晓峰，李鑫，李建华，杨大伟，刘旭，蒋迪，孙敏娜，赵刚，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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