The invention discloses a pseudorabies virus gE/gI deletion mutant strain rPRV AH gI with double expression of gC gene.
【技术实现步骤摘要】
双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用
本专利技术涉及动物病毒学及基因工程学
，更具体地，涉及一株双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株及其构建和应用。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种急性传染病，主要临床症状有发热、神经系统症状、呼吸道症状等。猪是PRV唯一的天然宿主。PRV具有高潜伏感染的特点，在许多国家广泛流行。伪狂犬病的控制正在使用广泛有效的灭活和减毒活疫苗。自上世纪70年代以来，Bartha-K61疫苗被引入中国，伪狂犬病在中国得到了有效的控制。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪流产、产死胎、木乃伊胎的情况，仔猪出现神经症状及死亡等临床症状，且从部分猪场已分离出变异毒株。这表明，目前国内使用的商品化疫苗对PRV变异毒株的免疫效果不佳，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头趋势。因此，为了有效控制PRV新型变异株的流行，需要开发高效针对PRV新型变异株的疫苗。专利CN201710590388.9公开了伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用，所述的伪狂犬病毒流行...
【技术保护点】
1.一种双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株，其特征在于，是在伪狂犬重组病毒rPRV‑AH‑gI
【技术特征摘要】
1.一种双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株，其特征在于，是在伪狂犬重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-缺失gE/gI基因位置处，通过插入gC基因构建得到的；所述gI/gE基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述gC基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.权利要求1所述的双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株1的制备方法，特征在于，包括如下步骤：S1.以狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，gC-F/gC-R为引物，扩增gC目的片段；以pEGFP-N1线性化质粒为模板，以FW-F/FW-R为引物，扩增pEGFP-N1骨架；S2.将纯化得到的gC片段与pEGFP-N1骨架分别用HindIII和BamHI进行双酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pgC-N1；以重组质粒pgC-N1为模板，EGFP-F1/EGFP-R1为引物扩增PCMV-gC-SV40polyA表达盒；将质粒pMD-LA-RA和纯化的PCMV-gC-SV40polyA分别用EcoRV酶切，连接转化，筛选得到重组质粒pMD-LA-RA-gC；S3.将重组质粒pMD-LA-RA-gC与重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+进行同源重组及空斑纯化，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选不出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+，即双表达gC基因的伪狂犬病毒gE/gI缺失突变株；所述引物gC-F、gC-R、FW-F、FW-R、EGFP-F1和EGFP-R1的核苷酸序列依次如SEQIDNO：4～9所示。3.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于，S2所述质粒pMD-LA-RA的制备方法包括如下步骤：S1.以伪狂犬病毒变异株PRV-AH株为模板，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R为引物，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧的用于同源重组的左臂LA和右臂RA；S2.将LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与RA片段分别用限制性内切酶HindШ和PstІ进行双酶切，酶切产物连接转化，得到重组质粒pMD-LA-RA；所述引物LA-F、LA-R、RA-F和RA-R的核苷酸序列依次如SEQIDNO：10～13所示。4.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于，S3所述重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP...
【专利技术属性】
技术研发人员：琚春梅，唐栋，陈美静，任小波，颜志斌，吴晓燕，潘慧，李艳华，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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