一种重组的伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）毒株ＨｚａｕＡＶＬ－ＰｒＶｄＴＫｄｇＥｄｇ Ｉ（ＣＧＭＣＣ，保藏日期：２００３年７月１７日，保藏编号：Ｎｏ．０９０７）。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物病毒学
，具体涉及一种人工构建的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)基因缺失突变株(PrV TK-/gE-/gI-)，利用基因工程方法和DNA重组方法将PrV的主要毒力基因TK和糖蛋白基因gI、gE编码区删除，导致PrV毒力下降，这种基因缺失突变株可以预防伪狂犬病。本专利技术还涉及所述的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗以及制备该疫苗的方法与应用。
技术介绍
伪狂犬病病毒(PrV)属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科，具有在细胞培养物上快速生长，强烈的神经嗜性与潜伏感染性等特性(Roizmorn B，Desrosiers R，Flecbenstein B，Lopez C，Minson Ad and studdertMJ.The family Herpesviridae；an update.Arch Virol.1992，123425-449)。该病可感染猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等各种家畜和野生动物。该病在猪呈爆发流行，引起母猪繁殖障碍和仔猪大量死亡，给养猪业造成巨大的经济损失；而在其它动物呈散发形式，但往往呈致死性感染。疫苗免疫是防制伪狂犬病的根本措施，在伪狂犬病防疫史上首先是灭活疫苗和弱毒疫苗。弱毒疫苗有返强的危险；灭活疫苗剂量大，有副作用，最大的缺点还在于传统的灭活疫苗免疫不能提供血清学标志进行鉴别诊断。随着分子生物学和基因工程技术的发展，人们研制出了基因缺失疫苗。PrV BUK d13突变株是第一次用酶切方法得到的TK基因缺失突变株可保护仔猪免受强毒的攻击，并且免疫猪在攻毒后很少往外排毒(Kit S，Kit M，Pirtle EC.Attenuated properties of thymidine kinase-negative deletionmutant of pseudorabies virus.Am J Vet Res，1985，461359-1367)。糖蛋白基因如gE、gG、gC缺失后(Moormann R J M，De Rover T，Briaire J，et al.Inactivation of the thymidine kinase gene ofa gI deletion mutant of pseudorabies virus generates a safe but still highly immunogenic vaccinstrain.J Gen Virol，1990，711591-1595)，疫苗免疫猪不产生针对所缺失基因的抗体，结合ELSIA试验可区为疫苗免疫猪和野毒感染猪，从而淘汰野毒感染猪，世界许多国家正是以此原理制定伪狂犬病的根除计划。我国在20世纪90年代末，曾先后研制了伪狂犬病油乳剂灭活疫苗和伪犬病TK-/gG-双基因缺失活疫苗，对伪狂犬病的防制发挥了重要作用(陈焕春等，伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gG-/LacZ+突变株的构建，病毒学报，2001，17(1)，69-74)。除了TK基因外，与伪狂犬病毒毒力有关的基因还有gE、gI等。由于gG基因不是毒力基因，为了进一步降低该毒株的毒力，提高安全性，我们在TK基因缺失的基础上，又缺失了gE、gI基因。郭万柱等(郭万柱等，新型伪狂犬病病毒基因缺失株的构建及生物学特征研究(初报)，四川农业大学学报，2000，18(1)1-3)以来自发病牛的PrV闽A株为材料，采用外切除缺失法获得的数株PrV TK/g1/gp63/LacZ三基因缺失株。其方法为对已克隆入pBR322中包含伪狂犬病病毒(PrV)胸苷激酶(TK)基因的BamHI-11片段进行改造，经筛选获得4株TK基因缺失重组质粒(PDTK)。用Ncol消化含有伪狂犬病病毒Fa株BamH I-7片段的质粒PBB7。回收目的的片段，经连接并转化E coli DH5a，获得缺失了gI和部分gE基因的重组质粒ppB7-1。将PrV Fa与PPB7-1 DNA共同转染PK15单层细胞，以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为PFDI-D63基因的重组质粒ppB7-1DNA后，回收大小约6.0kb片段，得到含gI片段的质粒pp63。其转移载体质粒pp63LacZ与PRV基因组DNA一道经同源重组，获得PrV Fag1/gp63/LacZ基因缺失株。以TK缺失重组质粒Pdtk3-6，pDtk5-6DNA与Fa g1/gp63/LacZ株(1-3、3-2、3-3)DNA通过TK143细胞同源重组，获得的数株PrV TK/g1/gp63/LacZ三基因缺失株，分别命名为PrV-SA3214、215、3132、3153、3155。其中SA215TK缺失约200bp、SA214、3132、3135 TK缺失约1100bp。对家兔、猪、山羊、绵羊、黄牛、水牛和犬等动物接种后经临床观察，结果除犬在接种后3天内连续出现39.8℃体温反应外其余畜种均无明显临床反应。采用SPA-ELISA进行抗体水平检测所有动物在第7d后均检测到伪狂犬病抗体且均达到1∶64以上。仔猪在免疫接种后经107PFU伪狂犬病毒鄂A株攻击，百分之百得到保护；在此研究的基础上，研制了狂犬病基因缺失疫苗SA215。其主要过程是先研制g1/gp63/LacZ基因缺失株，再研制TK/g1/gp63/LacZ；其缺陷在于g1/gp63系插入失活而非序列缺失，并且LacZ基因是菌源基因，不是伪狂犬病毒本身的基因，对动物体是否有副作用尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的任务在于克服现有技术存在的缺陷，利用基因重组方法提供一种TK、gE、gI基因缺失的，不含外源基因的伪狂犬病重组病毒。本专利技术的其中一个目的是制备所述病毒的方法。本专利技术的其中另一个目的是利用该重组的伪狂犬病病毒制备疫苗及其制备方法。本专利技术另一个专利技术目的是该重组的伪狂犬病病毒疫苗在防制伪狂犬病上特别是在防制猪伪狂犬病病上的应用本专利技术通过以下技术方案实现一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)毒株HzauAVL-PrVdTKdgEdg I(CGMCC，保藏日期2003年7月17日，保藏编号No.0907)。所说的重组伪狂犬病毒毒株缺失了TK、gE、gI基因并且不含外源基因。含有重组的伪狂犬病毒毒株的基因缺失疫苗，其毒株来源于一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus)毒株HzauAVL-PrVdTKdgEdgI(CGMCC，No.CGMCC0979，保藏日期2003年7月17日，保藏编号0907)。所说的的疫苗是活疫苗，其组分按7份伪狂犬病毒毒株1份明胶比例配制。制备所述的重组的伪狂犬病毒基因缺失疫苗的方法，其步骤包括1)毒株的制备用gE转移质粒pSPFZ与PrV TK-基因组DNA共转染猪肾传代细胞IBRS-2，在X-gal存在下进行蓝斑筛选，挑取蓝斑进行空斑纯化，空斑纯化三次后获得重组病毒PrV TK-/gE-/LacZ+突变株；对含有完整gE、gI基因的质粒pSKFB用Stu I和BamH I进行酶切，回收5753bp的片段连接，得到gE/gI缺失转移质粒pFBBS；将质粒pFBBS与EcoR I线性化的PrV TK-/gE-/LacZ+突变株基因组DNA共转染IBRS-2细胞；经过空斑本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈焕春，刘正飞，吴斌，金梅林，方六荣，何启盖，周复春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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