本发明专利技术涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建。该病毒以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学、细胞生物学等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+；以该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建
本专利技术涉及一种伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)双荧光标记基因缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)的构建，属于生物技术和动物病毒学领域。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名Aujeszky’sdisease，AD)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动物。猪是感染后可以存活的唯一物种，也是贮存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。PRV是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员，与其同属的还有I型牛疱疹病毒(BHV-1)、马疱疹病毒(EHV)以及水痘带状疱疹病毒(VSV)。PRV基因组为线性双股DNA，约145Kb，由长独特区(UL)和短独特区(US)及US两侧的末端倒转重复(TR)与内部重复(IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gI、gE、11K和28K为病毒增殖的非必需成份，一般认为，TK、gC、gE、PK和CP(衣壳蛋白)等与PRV毒力相关。疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为三种：一是常规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-K61株活疫苗；二是基因缺失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原性。目前构建的伪狂犬病病毒基因工程疫苗大多为TK、gI、gE、gG基因的单基因缺失或多基因缺失突变株。目前在我国批准生产使用的有TK和gG双基因缺失株(HB98株)活疫苗。PRV作为基因工程载体具备相当的优势：(1)PRV不感染人，具有很好的安全性。现有的活疫苗株Bartha-K61或‘783’等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安全事故。(2)基因组容量大：在PRV长达145Kb的基因组中，约一半基因被认为是非必需的，如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在这些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因而不显著影响其繁殖及免疫原性。(3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可以接种SPF鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病毒滴度很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。(4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以较长时间感染，外源基因可以在体内持续表达。(5)宿主范围广，多种家畜、经济动物(如狐和貂)、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是将自行分离并经鉴定命名为SX株的伪狂犬病病毒作为母本，经基因工程方法构建缺失gE、gI、US9和TK基因并插入GFP和RFP标记的重组病毒；并以该重组病毒作为伪狂犬活病毒载体系统，用于基因工程疫苗的开发和应用。本专利技术的技术方案1.一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+)，其特征在于，所表述的毒株同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因和TK基因四种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入绿色荧光蛋白(GFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因作为标记物，命名为伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株，该毒株已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.8879。2.如权利要求1所述的双荧光标记的伪狂犬缺失病毒的构建方法，其特征在于该毒株构建的步骤为：(1)分离和鉴定亲本毒株，命名为PRVSX株；(2)转移载体的构建，以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建两种转移载体：第一种转移载体为pMD-US6-GFP-US2，插入伪狂犬病病毒gI、gE和US9两端的US6和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22，插入伪狂犬病病毒TK基因两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；(3)双荧光标记缺失病毒的构建，pMD-US6-GFP-US2转移载体与亲本株PRVSX株共转染PK15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+；进而，再与pMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染PK15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株。3.权利要求包含如权利要求1所述的伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒在基因工程疫苗研制方面的应用，其特征在于rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株作为活载体病毒可插入一种和/或多种动物病原抗原基因，以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗，达到同时防制多种疾病的目的。本专利技术技术路线如下：1.从我国山西疑似PRV感染的病死猪中采集脑组织，提取DNA，利用PRV特异性引物进行PCR鉴定。将阳性脑组织进行冻融、离心、过滤等处理后接种PK15细胞进行病毒分离，并通过PCR方法、序列测定、特异性血清中和试验等手段进行鉴定。试验结果表明成功分离到一株PRV毒株，命名为SX株，PCR鉴定为PRV阳性，基因序列测定结果与GenBank上发表的PRV序列同源性在95％以上。该毒株能被PRV特异性阳性血清中和。2.通过基因克隆技术以PRV(SX株)部分US6和US2基因序列作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因GFP作为筛选标记构建转移载体pMD-US6-GFP-US2，将PRV(SX株)病毒和转移载体共转染PK15细胞获得缺失gE、gI和US9基因，同时插入GFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+。3.以TK基因两测的UL24和UL22部分基因序列为同源臂，以红色荧光蛋白基因(RFP)作为筛选标记构建转移载体pMD-UL24-RFP-UL22，将其与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+病毒共转染PK15细胞获得缺失TK基因同时插入RFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+。4.对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+进行生物特性分析，试验结果表明该重组病毒能在PK15细胞上稳定遗传，对小鼠安全。具体实施方式一、伪狂犬病病毒(SX株)的分离与鉴定1.病料处理无菌取PRV阳性脑组织(采自我国山西某猪场，经PRV特异性引物gI-F/gI-R(序列1/序列2)鉴定为PRV阳性，与PBS以1:10(V/V)比例匀浆，反复冻融3次，5000r/min离心30min，加入青链霉素各1000U/ml，4℃作用过夜，经0.45μm滤膜过滤除菌，-70℃保存备用，引物序列如下：gI-F5’-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒，其特征在于，所表述的伪狂犬病病毒同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因和TK基因四种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入GFP基因和RFP基因作为标记物，该毒株被命名为伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株，该毒株已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8879。
【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒，其特征在于，所表述的伪狂犬病病毒同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因和TK基因四种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入GFP基因和RFP基因作为标记物，该毒株被命名为伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)双荧光标记缺失病毒rPRV/gE-/gI-/US9-/TK-/GFP+/RFP+株，该毒株已于2014年05月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.8879。2.如权利要求1所述伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建方法，其特征在于该毒株的构建步骤为：(1)分离和鉴定亲本毒株，命名为PRVSX株；(2)转移载体的构建，以pMD-18T克隆载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：李俊平，陈晓春，杨承槐，李启红，李慧姣，夏业才，吴华伟，邓永，徐微，蔡青秀，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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