本发明专利技术提供一种荧光标记多糖的方法，使用上述方法标记的多糖，以及使用上述方法标记的多糖在制备用于研究多糖的口服吸收及其机制的药物中的用途。本发明专利技术的荧光标记多糖的方法具有操作简单，稳定时间长等特点。通过所述方法使不带有特殊基团的多糖成为易于检测的带有荧光的多糖，并且该标记方法对于多糖的内部结构和生物活性均无明显影响。使用本发明专利技术的方法制备的荧光标记的多糖可以用于其口服吸收、代谢排泄及药理等多方面的基础研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种标记多糖的方法，具体地，涉及一种荧光标记多糖的方法及以使用该方法标记的多糖及一种研究多糖的口服吸收及其机制的方法。
技术介绍
近年来，随着糖化学和糖生物学的不断发展，植物、海洋生物及菌类等各类中药来源的多糖已作为有生物活性的天然产物的一个重要类型出现。大量研究发现中药多糖参与及介导细胞内各种生命活动的调节，具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节，降血糖、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗凝血、抗缺氧、抗衰老等生物活性，且对机体的毒副作用小。因此，以糖类为基础的药物研究和开发已逐渐成为国内外医药界的前沿课题。多糖本身缺乏发色基团和荧光基团，这给多糖的微量检测带来了许多不便，因而中药多糖的口服吸收及药物代谢亦处于初步探索阶段，将多糖带上一定的基团使之可视成为了一种运用比较广泛的方法。荧光标记技术是一种非放射性的标记技术，它是通过将能发射荧光的物质共价连接或物理吸附到目标分子的某个基团上，通过检测荧光物质来实现对非荧光物质的定性和定量研究。近年来，研究者们利用各种方式将荧光基团标记在多糖的还原性末端(即，氨基、醛基或者羟基)上，但每种方法都各有优缺点。因此，研发一种操作简单、荧光稳定时间长且不影响多糖结构的荧光标记方法已成为业界的共识。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种荧光标记多糖的方法。本专利技术的另一个目的是提供使用上述荧光标记多糖的方法制备的荧光
标记的多糖。本专利技术的又一个目的是提供一种研究多糖的口服吸收及其机制的方法，所述方法使用上述荧光标记多糖的方法制备的荧光标记的多糖。根据本专利技术的一个方面，提供了一种荧光标记多糖的方法，该方法包括以下步骤：首先利用溴化氰将多糖进行活化，再将活化后的多糖与荧光素反应，使多糖接上荧光基团。更具体地，本专利技术提供了一种荧光标记多糖的方法，该方法包括以下步骤：(1)将多糖溶解于水中后，加入饱和溴化氰溶液反应，反应3-20分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化；(2)将步骤(1)中得到的纯化的溶液浓缩至干，用0.1-0.3M的硼砂溶液溶解，加入荧光素，避光反应后得到荧光标记的多糖。在本专利技术的方法中，优选地，步骤(1)中，优选所述反应在pH＞10，优选pH为10-12的条件下进行。在本专利技术的方法中，优选地，步骤(1)中，优选反应时间控制在5-10分钟，更优选7-10分钟，最优选约7min。在本专利技术的方法中，优选地，步骤(1)中，对反应终止后得到的溶液进行纯化的方法包括将反应终止后得到的溶液对水透析。在本专利技术的方法中，优选地，步骤(2)中，所述硼砂溶液的浓度为约0.2M，所述硼砂溶液的用量与所述多糖的用量的比例为0.1-1:1(V(ml)/W(mg))，更优选0.25-0.5:1(V(ml)/W(mg))；和/或，避光反应优选在溶液的pH为7-9，优选约8的条件下进行。在本专利技术的方法中，优选地，所述多糖可以是葡聚糖或者果胶多糖，例如，所述多糖可以是选自葡聚糖和果胶多糖的一种或多种。在本专利技术的方法中，优选地，所述多糖可以是植物、海洋生物及菌类等各类中药来源的多糖。在本专利技术的方法中，优选地，所述多糖可以、灰树花多糖、灵芝多糖、香菇多糖、天麻多糖或柑橘果胶多糖。所述多糖可以是市售的多糖或者可以采用本领域中的常规方法制备。在本专利技术的方法中，优选地，所述荧光素可以是德克萨斯红、丹磺酰乙二胺(DED)或者异硫氰酸荧光素。在本专利技术的方法中，在多糖的羟基上接上荧光基团。在本专利技术的方法中，荧光标记位点在多糖的C-6位羟基。根据本专利技术的另一个方面，提供了使用上述荧光标记多糖的方法制备的荧光标记的多糖。在本专利技术的荧光标记的多糖中，优选地，所述多糖可以是选自葡聚糖和果胶多糖的一种或多种。在本专利技术的荧光标记的多糖中，优选地，所述多糖可以是植物、海洋生物及菌类等各类中药来源的多糖。在本专利技术的荧光标记的多糖中，优选地，所述多糖可以是灰树花多糖、灵芝多糖、香菇多糖、天麻多糖或柑橘果胶多糖。在本专利技术的荧光标记的多糖中，在多糖的羟基上接上荧光基团。在本专利技术的荧光标记的多糖中，荧光标记位点在多糖的C-6位羟基。根据本专利技术的又一个方面，提供了一种研究多糖的口服吸收及其机制的方法，所述方法使用上述荧光标记多糖的方法制备的荧光标记的多糖进行。所述机制包括多糖的代谢排泄及药理等方面。在一个实施方式中，根据本专利技术的研究多糖的口服吸收及其机制的方法
包括，(1)使用根据本专利技术的荧光标记多糖的方法制备荧光标记的多糖；(2)使用步骤(1)得到的荧光标记的多糖研究该多糖的口服吸收及其机制。本专利技术的荧光标记多糖的方法具有操作简单，稳定时间长等特点。通过所述方法使不带有特殊基团的多糖成为易于检测的带有荧光的多糖，并且该标记方法对于多糖的内部结构和生物活性均无明显影响。使用本专利技术的方法制备的荧光标记的多糖可以用于其口服吸收、代谢排泄及药理等多方面的基础研究。附图说明图1为显示本专利技术所述的荧光标记多糖的方法的示意图。图2为麦芽糖(maltose)和棉籽糖(raffinose)在人肠黏膜上皮细胞HIMC的摄取图，图中标尺为10μm。图3为棉籽糖(raffinose)荧光标记前后的13C-NMR图。图4为麦芽糖(maltose)活化前后的1H-NMR图。图5为灰树花多糖GFPBW1荧光标记前后的13C-NMR图。图6为灰树花多糖GFPBW1标记前后的红外图(IR)。图7为灰树花多糖GFPBW1标记前后的生物活性图。图8为灰树花多糖GFPBW1、果胶多糖和荧光素丹磺酰乙二胺(DED)在人肠黏膜上皮细胞HIMC的摄取图，图中标尺为10μm。图9为果胶多糖在人结肠癌细胞HT-29的摄取图，图中标尺为10μm。具体实施方式下面将结合具体实施例来进一步描述本专利技术，但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。实施例1：荧光标记的灰树花多糖GFPBW1的制备配制饱和CNBr(购自美国Fluka公司)溶液及0.2M NaOH(购自中国
国药集团)溶液；称取20mg灰树花多糖GFPBW1(该多糖为本实验室自主制备，其结构为β-1,3连接的葡聚糖，具体制备方法及结构参见申请号为201110321162.1、专利技术名称为“β-葡聚糖GFPBW1及其制备方法和用途”的中国专利技术专利申请)溶于10ml蒸馏水中，充分搅拌溶解；加入4ml CNBr溶液，每次加入25μl NaOH溶液，不断地加入(保证pH>10)，持续7min,并观察溶液变化，若出现沉淀，则实验失败，重做；将上步中得到的反应液对蒸馏水透析，透析1-2天，毎2-3h更换透析外液；将袋内溶液浓缩至干,加入pH＝8的0.2M Na2B4O7.12H2O(硼砂)5-10ml，将浓缩物溶解后，加入少量的荧光素(约1mg)(丹磺酰乙二胺(DED)，购自加拿大TRC公司，本专利技术中下述实例中所用荧光素也为该荧光素)，避光反应过夜。将上步中得到的溶液转移至40℃水浴中继续避光反应24h。反应停止后，离心，取上清液对蒸馏水避光透析两天，离心后冻干，得到荧光标记的灰树花多糖GFPBW1(灰树花多糖-Fluo)，参见图1。实施例2：荧光标记的棉籽糖的制备该实施例中所述的棉籽糖购自美国sigma公司，具体的制备方法跟实施例1所述大致类似，所不同的是在每一步的反应后，产物的纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光标记多糖的方法，该方法包括以下步骤：首先利用溴化氰将多糖进行活化，再将活化后的多糖与荧光素反应，使多糖接上荧光基团。
【技术特征摘要】
1.一种荧光标记多糖的方法，该方法包括以下步骤：首先利用溴化氰将多糖进行活化，再将活化后的多糖与荧光素反应，使多糖接上荧光基团。2.根据权利要求1所述的荧光标记多糖的方法，该方法包括以下步骤：(1)将多糖溶解于水中后，加入饱和溴化氰溶液反应，反应3-20分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化；(2)将步骤(1)中得到的纯化的溶液浓缩至干，用0.1-0.3M的硼砂溶液溶解，加入荧光素，避光反应后得到荧光标记的多糖。3.根据权利要求2所述的荧光标记多糖的方法，其中，步骤(1)中，所述反应在pH＞10，优选pH为10-12的条件下进行；和/或，反应时间控制5-10分钟，优选7-10分钟，最优选约7分钟。4.根据权利要求2所述的荧光标记多糖的方法，其中，步骤(1)中，对反应终止后得到的溶液进行纯化的方法包括将反应终止后得到的溶液对水透析。5.根据权利要求2所述的荧光标记多糖的方法，其中，步骤(2)中，所述硼砂溶液的浓度为约0.2M，所述硼砂溶液的用量与所述多糖的用量的比例为0.1-1:1(V(ml)/W(mg))，优选0....
【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，廖文峰，王滢，曹殿秀，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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