一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测试剂盒，其包括用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。本发明专利技术方案的优势在于相较其他方法可以同时获得很高的特异性和灵敏度。并且，其操作简单，适合用于大规模的临床检测。

Detection kit for rifampin resistant mutation of Mycobacterium tuberculosis

The invention belongs to the technical field of biological medicine, relates to a mutation of rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis bacilli detection kit, comprising a reagent for OLA method using fluorescence labeled probe hybridization, ligation reaction. The advantage of the present invention lies in its high specificity and sensitivity in comparison with other methods. Moreover, the operation is simple and suitable for large-scale clinical detection.

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测试剂盒。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种危害人类健康的慢性传染病，是世界卫生组织重点控制的疾病之一。结核病(TubercuLosis,TB)是由结核分枝杆菌(MycobacteriumtubercuLosis，MTB)感染引起的以呼吸道传播为主的传染病，是单因致死率最高的慢性传染性疾病。据WHO估计，全世界约有1/3人口为结核带菌者，其中约5-10％的携带者可发展为活动性结核病，每年新发病例1000万，超过300万人死亡。我国作为全球22个结核病高负担国家之一，肺结核病人的数量仅次于印度而位居世界第二，且我国肺结核具有感染率高(占总人口的44.5％)、发病率高和耐药率高等流行特点。第五次中国结核病流行病学抽样调查(2010年)的结果显示，我国现有活动性肺结核患者总数为523万(其中传染性肺结核患者总数为134万)，总体耐药率36.8％。为控制结核危机WHO制订全程督导短程化学治疗策略作为国家结核病规划的核心内容，其重点在于化疗治疗药物的正规使用。目前一线口服抗结核药物为异烟肼，利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇及链霉素。近几十年来，耐药结核病向全球结核病控制提出了严峻的挑战。WHO估算全球耐多药结核约有100万例，中国占26.7％。中国每年发生耐多药结核病患者为全球最高，约占全球病例的1/4。结核分枝杆菌是慢生长分枝杆菌，常规的药敏试验需3-4周，液体快速培养法也需要8-14天，因此结核患者通常不能得到及时有效的治疗，导致耐多药结核患者结核菌的增殖和传播。目前研究的热点耐药位点主要集中在利福平耐药基因rpoB,即分枝杆菌RNA聚合酶α亚单位的编码基因，95％的结核杆菌利福平耐药与rpoB基因利福平耐药决定区突变有关，且突变无地区差异，突变点主要是516位、526位和531位密码子。目前，利福平耐药突变检测方法有：ARMS荧光PCR法、探针熔解曲线法、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、基因芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。1、ARMS荧光PCR法：扩增阻碍突变系统(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出基因突变。2、探针熔解曲线法：其原理是在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)，从而判读结果，其优点是闭管操作，结果判读简单，缺点是灵敏度有待提高。3、限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5-10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。4、基因芯片法：该方法是将探针固定于支持物上，如玻片或膜，通过PCR方法扩增出靶基因，再通过杂交手段进行芯片杂交，应用仪器进行结果判读。该方法可以进行高密度基因检测，但成本高、操作繁琐、检测流程相对较长，在市场推广上将受到一定限制。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种能在灵敏度和特异性均足够高的检测结核分枝杆菌利福平耐药突变的试剂盒。专利技术首先提供了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，包括用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。进一步地，专利技术提供了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，包括：a.结核分枝杆菌DNA提取试剂；b.用于扩增利福平耐药突变相关基因的试剂；c.用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂；d.用于对连接产物进行探针检测的试剂。本专利技术提供的方法包括：步骤1、提取经培养的结核分枝杆菌的样本基因组DNA；步骤2、以步骤1为模板经PCR分别扩增出耐利福平的基因片段；步骤3、应用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应；步骤4、连接产物经毛细管电泳法进行连接探针的片段检测。不同于目前用于福平耐药突变检测的ARMS荧光PCR法、探针熔解曲线法、RFLP或基因芯片法等，本专利技术采用的是PCR扩增结合OLA法来检测福平耐药突变。专利技术人经过与多种方法的比较发现，在检测福平耐药突变方面，通过本专利技术所筛选到的探针，采用PCR结合OLA法检测福平耐药突变可以同时获得良好的灵敏度和特异性。这在福平耐药突变检测方面是非常有利的。由于利福平耐药菌株的检测是通过检测混合菌株中的耐药菌株，在检测耐药菌株的时候，会有敏感菌株的干扰。如果耐药菌株在整个菌群中所在比例有限，既要检测出耐药菌株，同时保证不能检测出敏感菌株，基因OLA方法检测耐药菌株具有一定的优势。本专利技术采用了优化的扩增引物对结核分枝杆菌DNA的目标片段进行扩增。该引物根据结核分枝杆菌利福平耐药决定区(RRDR)所在的rpob基因序列(Genbank:L27989)设计，并经过专利技术人的筛选最终获得最优选的引物：rpoBSF:SEQNOID.11GTCGGCATGTCGCGGATGGAGCGGGT；rpoBSR:SEQNOID.12GCACGTCGCGGACCTCCAGCC。进一步地，本专利技术提供了进行扩增的PCR体系，包括：5XTaqPCRBuffer：1XdNTP：0.1mM-2mMMg2+：1mM-4mM引物：0.1uM-0.5uMTaqDNA聚合酶：0.5-5UDNA模板：2×104菌/mL-2×107所提取的DNA。探针组的选择在本专利技术方案中是十分重要的因素，因其对最终检测的灵敏度和特异性起着重要的影响作用。探针的长度也需要非常考究地选择，这由突变位点及其所处环境的特点决定，专利技术人发现即使碱基序列类似的探针，但因长度不同，特异性及灵敏度均受到其影响。在本专利技术的一个特别优选的实施例中，采用了如下探针。探针组1：R516A1：SEQNOID.1AGCTGAGCCAATTCATGGA；R516A2：SEQNOID.2AGCTGAGCCAATTCATGGC；R516A3：SEQNOID.3AGCTGAGCCAATTCATGGG；R516A4：SEQNOID.4AGCTGAGCCAATTCATGGT；R516B1：SEQNOID.5CCAGAACAACCCGCTGTCATC；探针组2：R526A1：SEQNOID.6CTGTCGGGGTTGACCC；R526A2：SEQNOID.7CTGTCGGGGTTGACCA；R526B1：SEQNOID.8ACAGCGCCGACTGTCAATAAAA；探针组3：R531A1：SEQNOID.9CACAGCGCCGACTGTC；R531B1：SEQNOID.10GGCGCTGGGGCCCAATAACAATG。上述SEQNOID.5、SEQNOID.8和SEQNOID.10的3’端连接荧光基团。荧光基团可选地为FAM，其他可用的荧光基团有HEX，TET，JOE，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，其特征在于包括：用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，其特征在于包括：用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。2.一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，其特征在于包括：a.结核分枝杆菌DNA提取试剂；b.用于扩增利福平耐药突变相关基因的试剂；c.用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂；d.用于对连接产物进行探针检测的试剂。3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，包括探针组，所述探针组选自以下任意一组或多组：探针组1：R516A1：SEQNOID.1AGCTGAGCCAATTCATGGA；R516A2：SEQNOID.2AGCTGAGCCAATTCATGGC；R516A3：SEQNOID.3AGCTGAGCCAATTCATGGG；R516A4：SEQNOID.4AGCTGAGCCAATTCATGGT；R516B1：SEQNOID.5CCAGAACAACCCGCTGTCATC；探针组2：R526A1：SEQNOID.6CTGTCGGGGTTGACCC；R526A2：SEQNOID.7CTGTCGGGGTTGACCA；R526B1：SEQNOID.8ACAGCGCCGACTGTCAATAAAA；探针组3：R531A1：SEQNOID.9CACAGCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾庆，杨湘玲，张中满，黄兰兰，冼伟杰，王晓艳，刘焕亮，
申请(专利权)人：广州好芝生物科技有限公司，中山大学附属第六医院，
类型：发明
国别省市：广东,44