用于多重PCR的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于存在于样品中的一个或多个核酸的多重PCR的方法、组合物、试剂盒、系统和装置。具体地，提供了允许对一个或多个靶序列进行选择性扩增的各种靶特异性引物。在一个方面，本发明专利技术涉及用于选择性扩增与癌症或遗传病相关的一个或多个靶序列的靶特异性引物。在一些方面，使用所公开的方法、试剂盒、系统和装置获得的扩增的靶序列可用于各种下游处理，包括核酸测序和用于检测遗传变体的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多重PCR的方法和组合物相关申请的交叉参考本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2011年4月28日提交的美国临时申请号61／479,952、2011年9月6日提交的美国临时申请号61／531,583、2011年9月6日提交的美国临时申请号61／531,574、2011年9月22日提交的美国临时申请号61／538,079、2011年11月29日提交的美国临时申请号61／564,763、2011年12月20日提交的美国临时申请号61／578,192、2012年2月2日提交的美国临时申请号61／594,160、2012年2月14日提交的美国临时申请号61／598,881、2012年2月14日提交的美国临时申请号61／598,892、2012年4月17日提交的美国临时申请号61／625,596和2012年4月26日提交的标题为“用于多重PCR的方法和组合物"的美国临时申请号61／639,017的优先权，将所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。序列表本申请在此通过引用并入随同提交的电子序列表的材料。将电子序列表的材料作为2012年4月25日创建的标题为“2012_04_25LT00503PCT_ST25.txt"的文本(.txt)文件提交，其具有18943KB的文件大小，并且在本文中通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及用于扩增包含多个靶序列的样品内的一个或多个靶序列的方法、组合物、系统、装置和试剂盒。任选地，在单个扩增反应中扩增多个靶序列，例如至少10、50、100、500、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000或100000个靶序列。在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及用于从单个来源例如基因组DNA或福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)DNA扩增一个或多个靶序列的方法、组合物、系统、装置和试剂盒。具体地，公开了用于使用具有可切割基团的引物扩增一个或多个靶序列的方法、试剂盒、系统、装置和组合物。背景几个生物学应用牵涉选择性扩增群体内的核酸分子。例如，下一代测序法可涉及分析一大群核酸分子内的选择的靶。对于这样的应用，增加可在单个扩增反应内从群体选择性扩增的靶的总数将是有用的。这样的选择性扩增通常通过使用一个或多个能选择性与特定靶核酸分子杂交或选择性促进其扩增的引物来实现。这样的选择性扩增可因扩增假象例如引物二聚体等的形成而复杂化。这样的扩增假象(在本文中也称为非特异性扩增产物)的形成可消耗关键扩增试剂例如核苷酸、聚合酶、引物等。此外，此类假象相对于期望的产物通常可具有更短的长度，在该情况下可比期望的产物更高效地扩增并且占据反应输出的主体。选择性扩增还可因“超级扩增子”的形成即延长的扩增子的形成而复杂化，当第一引物的延伸延伸通过相邻靶核酸序列时，这会发生，从而产生长的非特异性扩增产物，其可用作利用第二引物进行延伸的模板。此类假象在扩增反应中的形成，即使当仅使用单对引物时，亦可使下游应用例如qPCR、克隆、基因表达分析和下一代测序的样品制备复杂化。在一些下游应用(包括几个下一代测序方法)中，该问题可被实施第二扩增步骤的需要复杂化，因为在第二扩增过程中假象可被进一步放大。例如，下游测序应用可涉及使用乳液PCR(“emPCR")产生克隆地扩增的核酸群体(所述核酸群体被单个地连接至单独的支持载体例如珠粒)和通过阳性选择进行的克隆的扩增子的富集。在这样的应用中，假象可在从文库产生过程至emPCR阶段一直存在，产生包含非特异性扩增产物的DNA捕获珠粒。这些含假象珠粒可在使用含模板的珠粒富集过程中被选择但在遗传上是无信息的。可将多重PCR反应中扩增的核酸分子用于许多需要或不需要进一步纯化或操作的下游分析或测定。例如，当以充足的产率获得时，多重PCR反应的产物(扩增子)可用于单核苷酸多态性(SNP)分析、基因分型、拷贝数变异分析、表观遗传学分析、基因表达分析、杂交测定、基因突变(包括但不限于缺失)的分析、疾病状态的预后和／或诊断、罕见或低频率等位基因突变的检测和分析、核酸测序(包括但不限于从头测序或靶向再测序)等。示例性下一代测序系统包括IonTorrentPGMTM测序仪(LifeTechnologies)和IonTorrentProtonTM测序仪(LifeTechnologies)，所述测序系统是基于离子的测序系统，其通过检测作为核苷酸掺入的副产品产生的离子来测定核酸模板的序列。通常地，氢离子作为在利用聚合酶的模板依赖性核酸合成过程中发生的核苷酸掺入的副产品释放。IonTorrentPGMTM测序仪和IonProtonTM测序仪通过检测核苷酸掺入的氢离子副产品来检测核苷酸掺入。IonTorrentPGMTM测序仪和IonTorrentProtonTM测序仪包括多个待测序的核酸模板，每一个模板被置于阵列的各个测序反应孔内。阵列的孔各自被偶联至至少一个可检测作为核苷酸掺入的副产品产生的H+离子的释放或溶液pH的变化的离子传感器。离子传感器包括偶联至可感知H+离子的存在或溶液pH的变化的离子敏感性检测层的场效应晶体管(FET)。离子传感器提供表征核苷酸掺入的输出信号，所述信号可表示为电压变化值，其辐度与各孔或反应室中的H+离子浓度相关。不同的核苷酸类型连续流入反应室，并且被聚合酶按照由模板序列决定的顺序掺入正在延伸的引物(或聚合位点)。每一个核苷酸掺入伴随着H+离子在反应孔中的释放，连同局部pH的伴随变化。H+离子的释放被传感器的FET记录，这产生了表征核苷酸掺入发生的信号。在特定核苷酸流动过程中未被掺入的核苷酸将不产生信号。来自FET的信号的大小还可与掺入正在延伸的核酸分子的特定类型的核苷酸的数目相关，从而允许分辨同聚物区域。因此，在测序仪运行过程中，至反应室中的多个核苷酸流动连同跨多个孔或反应室的掺入监控允许仪器同时分辨许多核酸模板的序列。关于IonTorrentPGMTM测序仪的组成、设计和操作的更详细内容可见于例如美国专利申请系列号12／002781，现公布为美国专利申请号2009／0026082；美国专利申请系列号12／474897，现公布为美国专利公布号2010／0137143；和美国专利申请系列号12／492844，现公布为美国专利公布号2010／0282617，将所述申请全部通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，扩增子可经操作或通过桥式扩增或emPCR被扩增来产生多个适合用于多种下游过程(包括核酸测序)的克隆模板。在一个实施方案中，可使用本文中概述的靶特异性扩增技术的一个或多个技术从核酸分子的群体制备待使用IonTorrentPGMTM或IonTorrentProtonTM系统测序的核酸模板。任选地，在靶特异性扩增后，可进行第二和／或第三扩增过程，包括但不限于文库扩增步骤和／或克隆扩增步骤例如emPCR。随着样品核酸群体内期望被扩增的核酸靶数目增加，选择性扩增这些靶同时避免不期望的扩增假象形成的挑战会相应地增加。例如，假象(包括引物二聚体和超级扩增子)的形成在多重PCR反应(其中将用于多个靶的PCR引物对组合在单个反应管中并且共扩增)中可能是个更大的问题。在多重PCR中，额外的引物对以相对于模板DNA升本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于扩增样品中的多个不同靶序列的方法，包括：在单个扩增反应混合物中扩增来自包含多个不同的靶序列的样品的至少100个不同的靶序列，其中扩增包括在扩增条件下将至少一些部分的样品与多个靶特异性引物和聚合酶接触，从而产生至少100个不同的扩增的靶序列，其中至少两个不同的扩增的靶序列彼此具有低于50％的互补性，并且其中所述多个靶特异性引物的至少一个和扩增的靶序列的至少一个包含可切割基团；切割至少一个扩增的靶序列的可切割基团；将至少一个接头以平末端连接反应的方式连接至至少一个扩增的靶序列，从而产生一个或多个接头连接的扩增的靶序列，和再扩增至少一个所述接头连接的扩增的靶序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.28 US 61/479,952;2011.09.06 US 61/531,574;1.一种用于扩增样品中的多个不同靶序列的方法，包括：在单个扩增反应混合物中扩增来自包含多个不同的靶序列的样品的至少100个不同的靶序列，其中扩增包括在扩增条件下将至少一些部分的样品与多个靶特异性引物和聚合酶接触，从而产生至少100个不同的扩增的靶序列，其中至少两个不同的扩增的靶序列彼此具有低于50％的互补性，并且其中所述多个靶特异性引物的至少一个和扩增的靶序列的至少一个包含可切割基团；切割至少一个扩增的靶序列的可切割基团；将至少一个接头以平末端连接反应的方式连接至至少一个扩增的靶序列，从而产生一个或多个接头连接的扩增的靶序列，和再扩增至少一个所述接头连接的扩增的靶序列。2.权利要求1的方法，其中至少一个接头中的一个或多个与至少一个扩增的靶序列基本上不互补。3.权利要求1的方法，其中再扩增包括在扩增条件下将至少一个接头连接的扩增的靶序列与一个或多个引物和聚合酶接触，从而产生至少一个再扩增的接...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·利蒙，M·安德森，M·桑顿，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US