The present invention relates to a genetic diversity of pathogenic bacteria of Verticillium Wilt of cotton research method, which comprises the following steps: 1) isolated pathogenic bacteria: Cotton Verticillium Wilt of cotton stalk plants with alcohol wipe, peeling, removing the head end peeled, cut into pieces, into the first medium, get the spores and hyphae; 2) single spore purification by inoculating loop scraping the spores and hyphae, mixed with sterile water, get the spore and mycelium suspension; the spore and mycelium suspension in second medium are crossed, colony; with the inoculating needle picking single bacteria placement to third medium, get the diameter of 5 8cm colony; 3) fungal DNA extraction: the third culture based on the centrifuge tube, drying, adding beads, frozen in liquid nitrogen after the shock, grinding, extraction DNA, extraction and quality by gel electrophoresis; 4) the establishment of ISSR system . The invention greatly shortens the time for separating and purifying the pathogen of Verticillium Wilt of cotton; the ISSR system is reduced, and the amplified bands are still high in polymorphism, strong in specificity, clear in background and cost saving.
【技术实现步骤摘要】
棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法
本专利技术涉及植物病理学及分子生物学领域,特别是涉及一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法。
技术介绍
棉花黄萎病是危害棉花的重要病害之一,成为制约我国棉花生产仅次于棉铃虫的第二大杀手。其病原菌为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae),由于其为土传性维管束真菌性病害,目前缺乏有效的防治措施。由于该菌易于变异,因而经常出现同一个品种在不同地区的表现抗病性不同的情况。收集不同地区菌株,快速提取其DNA,准确地鉴定棉花黄萎病菌种群多样性及菌系间的亲缘关系和变异程度,对于抗病育种工作及病害的防治具有重要的实践意义。棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究主要分为黄萎病病原菌的分离、真菌DNA提取和研究真菌多样性等步骤。目前黄萎病病原菌的分离采用的是常规组织分离法。首先采集黄萎病病株,然后用升汞、双氧水或次氯酸钠消毒,无菌水冲洗3-4遍,然后培养、纯化,纯化后再根据需要再培养。升汞即氯化汞,剧毒,渗透性强,通常用于组织分离时消毒部分,操作要十分谨慎。升汞灭菌后要无菌水冲洗数遍,再用无菌滤纸把残余的水分吸干,以防残留的升汞影响病原菌生长。为防止交叉污染,一般每分离一个样品就要换一套冲洗器皿,所用器皿也非常多,在有限的超净台里面显得非常拥挤,容易混乱,平均每个样品耗时10min分钟左右。双氧水或次氯酸钠消毒,同样需要类似的步骤。现阶段,真菌DNA提取方法都基于菌丝的获得。大丽轮枝菌一般是边生长边产生大量的孢子和菌核,生长缓慢,培养物质地比较坚硬,附在培养基表面,很少有蓬松的气生菌丝,不易直接从培养基上获得菌丝。需要从纯化后培养10 ...
【技术保护点】
一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法,其特征在于,其步骤包括:1)分离病原菌:将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭,剥皮,除去剥皮后的头端后,截成小段,埋入第一培养基,得到孢子和菌丝;2)单孢分离纯化:用接种环刮取所述的孢子和菌丝,和无菌水混合,得到孢子和菌丝悬浮液;取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线,得到菌落;用接种针挑取单菌落点到第三培养基中,得到直径5‑8cm的菌落;3)真菌DNA提取:取所述第三培养基上的培养物于离心管,吹干,加入磁珠,在液氮中冷冻后,震荡研磨,提取DNA,并用凝胶电泳检测提取质量;4)建立ISSR体系。
【技术特征摘要】
1.一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法,其特征在于,其步骤包括:1)分离病原菌:将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭,剥皮,除去剥皮后的头端后,截成小段,埋入第一培养基,得到孢子和菌丝;2)单孢分离纯化:用接种环刮取所述的孢子和菌丝,和无菌水混合,得到孢子和菌丝悬浮液;取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线,得到菌落;用接种针挑取单菌落点到第三培养基中,得到直径5-8cm的菌落;3)真菌DNA提取:取所述第三培养基上的培养物于离心管,吹干,加入磁珠,在液氮中冷冻后,震荡研磨,提取DNA,并用凝胶电泳检测提取质量;4)建立ISSR体系。2.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法,其特征在于,所述的棉秆小段为0.5-1.0cm。3.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法,其特征在于,所述的第一培养基、第二培养基和第三培养基均为PDA培养基。4.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法,其特征在于,所述的第一培养基的培养条件为26℃黑暗培养3-4d;所述的第二培养基的培养条件为26℃黑暗培养2-3d;所述的第三培养基的培养条件为26℃黑暗培养10-20d。...
【专利技术属性】
技术研发人员:张国丽,谢宗铭,叶春秀,李全胜,赵曾强,吕宁,孙国清,武冬梅,于航,
申请(专利权)人:新疆农垦科学院,
类型:发明
国别省市:新疆,65
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