一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术提供了一种魏斯氏菌的标记物，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供了以该标记物是否存在作为筛选条件，高效筛选魏斯氏菌的方法。该方法的筛选周期小于36h，分离、鉴定准确性接近100％，该方法无需镜检、提取基因组等繁琐的步骤，快速且高效，可实现高通量批量处理，极大减少了工作量，降低了成本。

A highly efficient marker for screening Klebsiella and its application

The present invention discloses one kind of marker for efficient screening of Klebsiella and its application, belonging to the field of microbial fermentation technology. The present invention provides a marker of Weiss's bacteria, its sequence is shown as SEQ ID NO.1. The present invention also provides a method for efficiently screening Klebsiella bacteria with the presence of the marker as a screening condition. The screening time of this method is less than 36h, isolation and identification accuracy close to 100%, without the need for microscopic examination, the genomic tedious steps, fast and efficient, can achieve a high throughput batch processing, greatly reducing the workload and reduce the cost.

【技术实现步骤摘要】
一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用
本专利技术涉及一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用，属于微生物发酵

技术介绍
魏斯氏菌是革兰氏阳性菌，属兼性厌氧、在有氧条件下生长迅速。不具备细胞色素、过氧化氢酶阴性。可通过磷酸戊糖和磷酸转酮酶途径异型发酵葡萄糖产D-和/或L-乳酸所，异型发酵葡萄糖还产CO2、乙醇和(或)乙酸。魏斯氏菌在15℃能生长，一般最适生长温度在30-37℃，有些菌株在42～45℃能生长。大部分魏斯氏菌来源于营养丰富的食品，食品来源的魏斯氏菌发酵产乳酸、乙酸、乙醇可增加发酵食品的风味及营养，其中产细菌素的W.cibaria应用于食物，可起到防腐的作用；W.confusa合成葡聚糖、果聚糖，能有效地促进体内有益菌生长，抑制腐败菌生长；泡菜中W.koreensis菌株通过合成纤维素，具有抗肥胖效果。目前分离鉴定魏斯氏菌的技术有通过菌落形态特征观察、革兰氏染色镜鉴、接触酶试验、甲基红试验、V-P试验、明胶液化试验、吲哚试验、淀粉水解试验等生理生化试验对菌株进行分离鉴定；通过糖发酵试验、菌株在4％NaCl、6.5％NaCl下是否生长，菌株在温度为10、40、45℃下是否生长的试验，初步进行魏斯氏菌种间鉴定。但是筛选周期通常需要一周左右，且需测定的参数多、步骤繁琐、工作量大。利用生理生化指标分离筛选鉴定魏斯氏菌，准确性不高，需进一步的扩增菌株的16SrDNA序列进行验证。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种魏斯氏菌的标记物，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种筛选魏斯氏菌的方法，根据SEQIDNO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析和/或测序验证，扩增获得与SEQIDNO,1所示序列存在≥75bp连续相同的核苷酸序列的菌株，或能够扩增出片段大小为120～180bp的菌株即为魏斯氏属的菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述引物序列包括(1)～(5)任一对，其中，(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR是按照以下程序进行的：94℃30s，94℃3min，55℃30s，72℃1min，72℃10min，12℃保持，循环数32。在本专利技术的一种实施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为魏斯氏属(Weissella)的微生物。在本专利技术的一种实施方式中，采用上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)。在本专利技术的一种实施方式中，采用上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为窦氏魏斯氏菌(Weissellacibaria)。在本专利技术的一种实施方式中，采用上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为绿色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)。在本专利技术的一种实施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为类肠膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将待分离的混合菌在含万古霉素的选择性培养基上培养，获得单菌落，再进行菌落PCR。在本专利技术的一种实施方式中，所述万古霉素的含量为2.0～3.0g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述选择性培养基含有：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉4.0～6.0g/L、酵母粉3.0～5.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、吐温801.0～2.0mL/L、磷酸氢二钾2.0～3.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、柠檬酸三铵2.0～3.0g/L、硫酸镁0.2～0.5g/L、硫酸锰0.05～0.1g/L，L-半胱氨酸0.5～1g/L，那他霉素1.0～1.5g/L，万古霉素2.0～3.0g/L，初始pH为7.0～7.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述选择性培养基含有：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0mL/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，万古霉素2.0g/L，初始pH为7.0～7.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述魏斯氏菌是魏斯氏属的菌株，包括但不限于类肠膜魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、窦氏魏斯氏菌、绿色魏斯氏菌、微小魏斯氏菌、赫伦魏斯氏菌、坎氏魏斯氏菌、土壤魏斯氏菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养是按下述操作进行：将待分离的样品接种至选择性培养基，在37℃静置富集培养12～24h，将上述培养液稀释涂布至固体选择性培养基，37℃培养24～36h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：1)将样品接种于选择性培养基，置于37℃恒温培养箱中培养24h得培养液，所述的选择性培养基配方如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0mL/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，万古霉素20g/L，调节初始pH为7.0，；2)将上述培养液稀释涂布至固体选择性培养基，37℃培养36h；所述的固体选择性培养基是含20g/L琼脂的步骤(1)所述的选择性培养基；3)根据SEQIDNO.1设计引物，挑选步骤2)获得的单菌落进行特异性引物菌落PCR，PCR产物用2％浓度的琼脂糖凝胶电泳成像，能够得到大小为100～200bp的条带的菌株为魏斯氏菌。本专利技术还提供一种魏斯氏菌选择性培养基，所述培养基配方如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0mL/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L，L-半胱氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选魏斯氏菌的方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析和/或测序验证，扩增获得与SEQ ID NO,1所示序列存在≥75bp连续相同核苷酸的菌株即为魏斯氏属的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种筛选魏斯氏菌的方法，其特征在于，根据SEQIDNO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析和/或测序验证，扩增获得与SEQIDNO,1所示序列存在≥75bp连续相同核苷酸的菌株即为魏斯氏属的菌株。2.一种筛选魏斯氏菌的方法，其特征在于，根据SEQIDNO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析，成功扩增出片段大小为120～180bp的菌株即为魏斯氏属的菌株。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物序列包括(1)～(5)中任一对，其中：(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将待分离的混合菌在含万古霉素的选择性培养基上培养，获得单菌落进行菌落PCR；所述选择性培养基含有：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉4.0～6.0g/L、酵母粉3.0～5.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、吐温801.0～2.0mL/L、磷酸氢二钾2.0～3.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、柠檬酸三铵2.0～3.0g/L、硫酸镁0.2～0.5g/L、...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，李巧玉，徐洁，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32