本发明专利技术公开了绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用。本发明专利技术将绿色荧光蛋白编码基因插入到猪瘟病毒感染性克隆Npro蛋白编码区的第13位与第14位氨基酸之间，通过转染PK-15细胞、传代，拯救出可视化的绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒。所述重组猪瘟病毒的生长特性与其亲本病毒一致，感染PK-15细胞后通过荧光显微镜直接可视，用其建立的改进中和试验方法（EGFP-NT）能够借助荧光显微镜直接观察猪瘟病毒的存在与否并确定待检血清中的中和抗体效价，无需额外的免疫荧光试验步骤，其特异性和敏感性与传统的中和免疫荧光试验一致，却更加方便快捷，可替代中和免疫荧光试验方法用于猪瘟血清学检测和流行病学调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组猪瘟病毒，尤其涉及绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法，本专利技术进一步涉及该绿色荧光蛋白标记重组猪瘟病毒在诊断猪瘟或定量检测血清猪瘟中和抗体效价中的应用，属于猪瘟病毒的诊断或检测领域。
技术介绍
猪痕(classicalswine fever, CSF)是由猪痕病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的猪的一种以高热和出血为特征的高度接触性传染病，猪瘟的流行能够在全世界范围内引起重大经济损失。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virusl, BVDV-1 )、BVDV-2、边界病病毒(border disease virus, BDV)同属于黄病毒科痕病毒属成员(Moser C，Stettler P, Tratschin JD, et al.Cytopathogenic and noncytopathogenic RNA replicons of classical swine fever virus.J.Virol.1999, 73:7787-7794.)。CSFV基因组为线状单股正链RNA，长约12.3kb，含有一个大的开放阅读框架(open reading frame, 0RF),编码约3900个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白在病毒和宿主细胞蛋白酶作用下加工形成4种结构蛋白(C、Ems、El和E2)和7种非结构蛋白(#"。、？7、吧2-3、吧4八、吧48、吧5八和吧58) (Moser C, Stettler P, Tratschin JD, et al.Cytopathogenic and noncytopathogenic RNA replicons of classical swine fever virus.J.Virol.1999，73:7787-7794.)。CSFV反向遗传学技术早在1996年得以建立，利用体外转录的感染性RNA转染 SK-6 或 PK-15 细胞产生感染性病毒(Meyers Gj Thiel HJj Rumenapf T.Classical swine fever virus: recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles.J.Virol.1996，70:1588-1595.)，之后将CSFV的全长感染性克隆转染表达T7RNA聚合酶的SK-6或PK-15细胞系，利用细胞内转录的方式改进了 CSFV的反向遗传技术 (van Gennip HG, van Rijn PA,Widjojoatmodjo MN，et al.Recovery of infectious classical swine fever virus (CSFV) from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7RNA polymerase.J.Virol.Methodsl999，78:117-128.)。最近，本专利技术人用巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子控制下的CSFV的全长感染性克隆转染PK-15细胞，利用细胞内的RNA聚合酶II启动感染性克隆的转录，成功拯救CSFV，使CSFV的反向遗传技术更加有效方便(Li C，Huang JHj Li YFj et al.Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system.Arch.Virol.2012,do1:10.1007/ S00705-012-1548-8)。表达细菌氯霉素乙酰转移酶的标记CSFV曾被用于猪瘟病毒的定量石开究(Moser C，Tratschin JDj Hofmann MA.A recombinant classical swine fever virus stably expresses a marker gene.J.Virol.1998，72:5318-5322.) 文献报道猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syn drome virus, PRRSV)等多种绿色荧光蛋白标记的病毒得以成功构建(Fang Y, Rowland RRRj Roof M，et al.A full-length cDNA infectious clone of North American typelporcine reproductive and respiratory syndrome virus: expression of green fluorescent protein in the Nsp2region.J.Virol.2006，80:11447-11455;Fang Y，Christopher-Hennings Jj Brown E，et al.Development of genetic markers in the nonstructural protein2region of a US typelporcine reproductive and respiratory syndrome virus:1mplications for future recombinant marker vaccine development.J.Gen.Virol.2008, 89:3086-3096;Kim DY,Calvert JG，Chang KOj et al.Expression and stability of foreign tags inserted into nsp2of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV).Virus Res.2007，128:106-114.)。为了控制和根除猪瘟，血清学调查是必需的手段。酶联免疫吸附试验 (enzyme - linked immunosorbent assay, ELISA)、中和免疫突光试验(neutralization immunofluorescence test, NIFT)和中和过氧化物酶联试验(neutralization peroxidase-linked assay, NP LA)是常用的检测血清中猪痕抗体的方法。多种ELISA诊断方法已经建立而且其中几种已经商业化，如IDEXX CSFV Antibody Test Kit和IDEXX CSF Sero Ab ELISA。特别是IDEXX CSFV Antibody Test Kit作为一种可靠的血清抗体检测方法已在疫苗评价及猪瘟的血清学调查中得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒，其特征在于：包括猪瘟病毒和绿色荧光蛋白编码基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，李永锋，孙元，李素，罗玉子，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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