本发明专利技术公开了一种鼠肝炎冠状病毒的LUC示踪系统及其应用。本发明专利技术所提供系统为重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b；所述插入为在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有Gaussia荧光素酶编码基因的DNA片段编码的RNA。本发明专利技术的MHV-LUC可与野生型病毒平行用于研究。另外，由于LUC的信号放大效应，MHV-LUC可极大提高病毒监测灵敏度，为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供了新思路，为抗冠状病毒药物筛选等应用研究也提供新技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鼠肝炎冠状病毒的活体成像示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生型鼠肝炎冠状病毒A59株基因组中插入Gaussia荧光素酶基因后得到的重组鼠肝炎冠状病毒。
技术介绍
冠状病毒是目前已知的基因组最大的单股正链RNA病毒，主要引起呼吸道和消化道的疾病，是多种经济动物传染性疾病的病原体，常常导致巨大的社会经济损失。自2003年一种新的SARS-CoV被确定为烈性传染病SARS的病原体以来，冠状病毒(Coronavirus)便成为全球生命科学研究的热点之一。生物荧光示踪技术是近年来发展起来的一项崭新的分子、基因表达的分析检测技术。在分子生物学研究领域，结合荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子进行荧光示踪监测和检测。Gaussia荧光素酶是分离于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类动物的新型荧光素酶。通过报告基因载体，Gaussia突光素酶可用于哺乳动物细胞表达。表达后的Gaussia荧光素酶为单条肽链的单体酶，其分子较小(187aa)，且具有分泌性信号肽，因此可通过内质网分泌到细胞外。该荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应并且发光(480nm)，该反应无需ATP参与。与其他荧光素酶相比，使用Gaussia荧光素酶作为报告基因有更多的优势:1.分泌型荧光素酶，可直接取上清检测，无须裂解细胞；2.发光强度高，是其它荧光素酶的I千倍；3.反应无须ATP，不受ATP影响；4.稳定性高，对温度、pH值等耐受性强。目前尚未有对鼠肝炎冠状病毒进行Gaussia荧光素酶示踪的相关报道
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鼠肝炎冠状病毒的Gaussia荧光素酶示踪系统及其应用。所述鼠肝炎冠状病毒的Gaussia荧光素酶示踪系统即为一种表达Gaussia荧光素酶的重组鼠肝炎冠状病毒。本专利技术所提供的重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为:将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段(可由I个、2个或更多个核糖核苷酸组成)换为片段b ；所述插入为:在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b;所述片段a为序列表中序列I编码的RNA ;所述片段b为含有Gaussia荧光素酶编码基因的DNA片段编码的RNA。所述Gaussia荧光素酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。在本专利技术中，所述Gaussia荧光素酶的编码基因为序列表中序列3的第15-575位。进一步，所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段的序列为序列表中序列3。在本专利技术的一个实施例中，所述野生型鼠肝炎冠状病毒具体为鼠肝炎冠状病毒A59 株。在本专利技术的一个实施例中，所述重组鼠肝炎冠状病毒是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换得到的重组病毒；具体的，所述替换中，所述“片段a中的任一片段”为所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸对应的RNA片段。由于所述野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列(Up date:2012_8_23)，相应的，所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列(Update:2012-8-23)的第27967-28264位(对应序列I的第468-765位)替换为序列表中序列3，得到的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供一种制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法。本专利技术所提供的制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体可包括如下步骤:(a)将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列I中；(b)用含所述野生型 鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；(c)将步骤(b)中的所述重组痘苗病毒载体乙中的所述gpt基因替换为所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；(d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(C)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；(e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组鼠肝炎冠状病毒。在上述方法中，步骤(a)中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为 GenBank 号为 NC_001846.1 的序列(Up date:2012-8-23)的第 27500-27966位(对应序列I的第1-467位)和第28265-28700位(对应序列I的第766-1201位)。在本专利技术的一个实施例中，制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体包括如下步骤:(a)将GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(对应序列I的第1-467位，命名为上游同源臂)和第28265-28700位(对应序列I的第766-1201位，命名为下游同源臂)分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游(如酶切位点Not I和Sal I之间)和下游(如酶切位点Pst I和BamH I之间)，得到重组质粒，将其命名为pGPT-1N_0RF4 ；(b)用含鼠肝炎冠状病毒(MHV)A59株基因组cDNA的痘苗病毒载体vacciniavirus inf-1 (v.v.-1nf-1)感染CV-1细胞后,用步骤(a)获得的重组质粒pGPT_IN_0RF4转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒PGPT-1N-0RF4通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获得以所述gpt基因替代所述V.V.-1nf-Ι中的位于GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(Up date:2012_8_23)的第27967-28264位核苷酸序列的重组痘苗病毒载体，将其命名为V.V-1nf-gpt-1n ；(c)将步骤(a)中的所述重组质粒pGPT-1N_0RF4中的所述gpt基因替换为所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为：将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b；所述插入为：在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有Gaussia荧光素酶编码基因的DNA片段编码的RNA。
【技术特征摘要】
1.重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒； 所述替换为:将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b; 所述插入为:在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b; 所述片段a为序列表中序列I编码的RNA ;所述片段b为含有Gaussia荧光素酶编码基因的DNA片段编码的RNA。2.根据权利要求1所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述Gaussia荧光素酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。3.根据权利要求2所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述Gaussia荧光素酶的编码基因为序列表中序列3的第17-575位。4.根据权利要求3所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段的序列为序列表中序列3。5.根据权利要求1-4中任一所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述野生型鼠肝炎冠状病毒为鼠肝炎冠状病毒A59株；或 所述替换中，所述片段a中的任一片段为所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸对应的RNA片段。6.根据权利要求5所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA反转录的c DNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列的第27967-28264位替换为序列表中序列3，得到的核苷酸序列。7.制备权利要求1-6中任一所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法，包括如下步骤: Ca)将权利要求1-6任一中所述的野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲； 所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列I中； (b)用含权利要求1-6任一中所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：常国辉，刘京梅，孙走南，柳洪涛，杨益，吴晓燕，苏文莉，张雨，何湘，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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