本发明专利技术公开了一种用于细胞成像的荧光核苷及其制备方法和应用。该类核苷荧光染料在RNA含量少的细胞区域和组织内具有较低的背景荧光，在RNA含量高的细胞区域和组织内具有较强的荧光信号，且当细胞的黏度发生变化是，荧光强度及寿命也随之变化。由于网织红细胞仅含有RNA,所以此类荧光分子能从血细胞中筛选出网织红细胞，并对其进行多模式成像。这类化合物在水中具有一定溶解度，同时具有良好的水油两亲性，能穿过细胞膜；并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。此外，本发明专利技术的这类化合物还具有较低的生物毒性、光漂白性和高的光稳定性，且其光谱范围与生物样品的自身的光谱范围有足够大的差别。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类荧光核苷的合成方法，具体涉及一种用于细胞成像的荧光核苷及其制备方法和应用。
技术介绍
近些年来，由于各种原因，心脑血管疾病的发病率越来越高，且逐渐年轻化。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高,并发症多”等特点。目前，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。血黏度升高，导致人体新陈代谢速度减慢，血液流速会减慢，造成心脑供血不足进而引发冠心病、高血压、脑血栓等心脑血管疾病。所以建立一种简便的、快捷的、高效的、灵敏的血液黏度检测技术是预防和检测心脑血管疾病的一项重要的工作。对于宏观的大体积的黏稠流体的黏度测试方法是利用黏度计。但是，对于微环境(尤其是细胞内或生物组织内的黏度，利用黏度仪是不能实现其黏度的测定。目前，已经报道的年度转子主要有：荧光强度黏度转子、比例荧光黏度转子、荧光寿命年度转子、荧光比例和寿命双模式黏度转子。然而，这些转子都不能在网织红细胞甚至红细胞内成像和检测黏度。随着双光子技术的发展，双光子激光共聚焦显微成像在生命科学的研究中已经成为最重要的成像技术。与传统的单光子激光共聚焦显微成像相比，激光共聚焦显微成像具有明显优势，包括近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等(Helmchen F,Svoboda K,Denk W et al.Nature 1999,2,989-996.Zhang,H.；Fan,J.L.；Wang,J.Y.；Zhang,S.Z.；Dou,B.R.；Peng,X.J.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11663-11669.Zhang,H.；Fan,J.L.；Wang,K.；Li,J.；Wang,C.X.；Nie,Y.M.；Jiang,T.；Mu,H.Y.；Peng,X.J.；Jiang,K.Anal.Chem.2014,86,9131-9138)，因此双光子显微成像技术使生物成像研究进入了一个崭新的阶段。而对网织红细胞成像及其黏度变化的检测的专一性多模式成像的荧光核苷还尚未有人报道，开发专一性好的筛选网织红细胞及检测其粘度变化的荧光核苷是一个开创性的工作。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于细胞成像的荧光核苷及其制备方法和应用。本专利技术的技术方案是：一种用于细胞成像的荧光核苷，所述荧光核苷具有通式I结构：其中：B选自dA、dG、dC、dT或dU，其中R7独立选自烷基链、-H、-TBDMS、-Boc、-Ac或-DMTr；R1选自-Ph、-Ph(CH3)n、-Ph(CH2CH3)n、-Ph((OCH2CH2)nOCH3)m、-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)m,-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)2或-PhN((OCH2CH2CH2)nOCH3)2,其中n选自1-8的整数；m选择1-3的整数；R2、R3、R4、R5各自独立地选自-CH3或-(CH2)nCH3，其中n选自1-8的整数；R6独立地选自-N(CH3)2或-N(CH2)nCH3，其中n选自1-8的整数；，其中n选自1-3的整数；L选自烷基链、-Ph-、-CH2-(CH＝CH)n-(C≡C)m-CH2-、-(CH2)nCH＝CH(CH2)n-或-(CH2)nC≡C(CH2)n-,其中n，m独立选自0-4的整数。作为本专利技术的进一步改进包括：所述的荧光核苷，选自下列化合物：本专利技术的另一目的在于提供了一种制备上述的荧光核苷的方法，包括以下步骤：)化合物a与三甲基硅基乙炔按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物b:反应温度为0-50℃，Pd、Cu和胺同时催化，反应时间为6-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醚或二恶烷中的至少一种；2)化合物b与四丁基氟化铵按照摩尔比1:0.8-1:4反应，制备化合物c：反应温度为0-50℃，反应时间为10min-5h，反应溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醚或二恶烷中的至少一种；3)将步骤1)或2)中制备得到的化合物b或c,分别与步骤化合物dAI按照摩尔比1:1-3反应，制备化合物dABp-1-dABp-4：反应温度为0-50℃，Pd、Cu和胺同时催化，反应时间为8-24h，反应溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醚或二恶烷中的至少一种。上述的荧光核苷在生物成像中的应用。所述的荧光核苷在生物成像中的应用，其生物样品是包括血细胞或网织红细胞在内的活细胞。本专利技术改进现有的黏度荧光核苷在应用的不足，设计并合成出双光子激发、适用于有效的、专一的识别含有RNA的网织红细胞(在血细胞中)及检测细胞粘度的并对其成像的荧光核苷。该类核苷荧光染料在RNA含量少的细胞区域和组织内具有较低的背景荧光，在RNA含量高的细胞区域和组织内具有较强的荧光信号，且当细胞的黏度发生变化是，荧光强度及寿命也随之变化。由于网织红细胞仅含有RNA,所以此类荧光分子能从血细胞中筛选出网织红细胞，并对其进行多模式成像。这类化合物在水中具有一定溶解度，同时具有良好的水油两亲性，能穿过细胞膜；并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。此外，本专利技术的这类化合物还具有较低的生物毒性、光漂白性和高的光稳定性，且其光谱范围与生物样品的自身的光谱范围有足够大的差别。本专利技术所述的荧光核苷具备以下优点：所述化合物引入了专一性识别和定位基团，提高了对细胞和组织识别的专一性、特异性；所述化合物具有良好的双光子性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性；所述化合物部分分子的荧光发射波长较长，可用于活细胞成像；所述化合物均可作为比例和寿命荧光核苷对网织红细胞进行成像，排除环境因素对荧光强度的干扰；所述化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易制备，易产业化。附图说明图1是实施例2表征本专利技术的荧光核苷化合物dABp-1对黏度的响应。测定方法为：将化合物dABp-1分别加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，测定荧光发射光谱。图2是实施例3表征本专利技术的荧光核苷化合物dABp-1在不同黏度下的荧光寿命的变化。测定方法为：将化合物dABp-1分别加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，测定荧光寿命。图3是实施例4表征本专利技术的荧光核苷化合物dABp-1在网织红细胞中不同成像模式下的成像图片。测定方法为：将10μL浓度为1mM的dABp-1的DMSO溶液加入到的网织红细胞中，在37℃，5％CO2下孵育50分钟，选取某一区域，用油镜(60×)观察，重复三次。图片收集波长490-520nm,550-580nm。图4是实施例6表征本专利技术的荧光核苷化合物dABp-2的水溶解性。测试方法：用不同浓度的dABp-2的水溶液，测试其在最大吸收下的荧光发射强度。图5是实施例7表征本专利技术的荧光核苷化合物dABp-2对细胞黏度的响应。测试方法：将10μL浓度为1mM的dABp-1的DMSO溶液加入到的HepG 2细胞中，在37℃，5％CO2下孵育30分钟，选取某一区域，分别在25℃和37℃下，用油镜(60×)观察、拍照，重复三次。图片收集波长490-520nm,550-580nm。图6是实施例8表征本专利技术的荧光核苷化合物dABp-3的生物毒性测试。测试方法：将不同浓度梯度的dA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于细胞成像的荧光核苷，其特征在于，所述荧光核苷具有通式I结构：其中：B选自dA、dG、dC、dT或dU，其中R7独立选自烷基链、‑H、‑TBDMS、‑Boc、‑Ac或‑DMTr；R1选自‑Ph、‑Ph(CH3)n、‑Ph(CH2CH3)n、‑Ph((OCH2CH2)nOCH3)m、‑Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)m,‑Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)2或‑PhN((OCH2CH2CH2)nOCH3)2,其中n选自1‑8的整数；m选择1‑3的整数；R2、R3、R4、R5各自独立地选自‑CH3或‑(CH2)nCH3，其中n选自1‑8的整数；R6独立地选自‑N(CH3)2或‑N(CH2)nCH3，其中n选自1‑8的整数；其中n选自1‑3的整数；L选自烷基链、‑Ph‑、‑CH2‑(CH＝CH)n‑(C≡C)m‑CH2‑、‑(CH2)nCH＝CH(CH2)n‑或‑(CH2)nC≡C(CH2)n‑,其中n，m独立选自0‑4的整数。
【技术特征摘要】
2016.03.11 CN 20161013788251.一种用于细胞成像的荧光核苷，其特征在于，所述荧光核苷具有通式I结构：其中：B选自dA、dG、dC、dT或dU，其中R7独立选自烷基链、-H、-TBDMS、-Boc、-Ac或-DMTr；R1选自-Ph、-Ph(CH3)n、-Ph(CH2CH3)n、-Ph((OCH2CH2)nOCH3)m、-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)m,-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)2或-PhN((OCH2CH2CH2)nOCH3)2,其中n选自1-8的整数；m选择1-3的整数；R2、R3、R4、R5各自独立地选自-CH3或-(CH2)nCH3，其中n选自1-8的整数；R6独立地选自-N(CH3)2或-N(CH2)nCH3，其中n选自1-8的整数；其中n选自1-3的整数；L选自烷基链、-Ph-、-CH2-(CH＝CH)n-(C≡C)m-CH2-、-(CH2)nCH＝CH(CH2)n-或-(CH2)nC≡C(CH2)n-,其中n，m独立选自0-4...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭海明，张言言，仉华，李建平，谢明胜，渠桂荣，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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