一种实时三维激光荧光成像装置，该装置同时兼容传统明场照明显微成像工作模式。所述实时三维激光荧光成像装置根据功能主要分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块，以及控制模块五个部分。利用空间光调制器加载角锥相位，从而在聚焦物镜后场产生高斯贝塞尔照明光场。在探测光路中，通过加入扭曲达曼光栅实现多物面同时成像，将从物镜收集的荧光通过多物面成像技术将多个轴向平面同时成像到电子增强CCD探测面上，从而实现了实时三维荧光成像。这种实时三维荧光成像技术在生物活体组织、活体细胞显微成像方面有重要的实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型三维显微成像技术，特别是一种实时三维荧光显微成像装置。
技术介绍
光学成像技术是一种非接触的无损成像技术，因而在生物活体或活体细胞等成像中有重要的应用。生物活体成像除了要求非接触无损探测之外，还要求能够得到实时动态的三维成像信息。目前，这种实时三维成像技术一般是基于振镜或压电陶瓷的空域扫描或者基于宽带光源的频域扫描实现的三维成像技术。这些动态三维成像技术都是基于扫描技术实现的动态成像，不是真正意义上的实时动态成像。1999年，英国科学家Blanchard等人【Appl.Opt.38,6692(1999)】提出了一种基于扭曲光栅的多个轴向物平面同时成像于一个像平面上的4D成像技术，该技术提供了一种真正意义上的实时三维成像技术，Blanchard等人把这种实时三维成像称为4D成像技术。然而，Blanchard等人提出的扭曲光栅最初是基于振幅型光栅设计的，因而，其主要衍射能量集中在零级，且整体能量效率非常低。随后，他们提出利用纯相位性光栅来提高整体衍射效率，同时可以改善衍射能量在0级和±1级之间的能量分布的均匀性。我们于2012年提出了扭曲达曼光栅的概念【先前技术CN201210106742】，可以实现几十个到上百个轴向物面同时成像到同一个像面上。本专利技术基于扭曲达曼光栅技术，提出一种实时三维激光荧光显微成像装置，该装置同时兼容传统明场照明显微成像工作模式。
技术实现思路
本专利技术基于扭曲达曼光栅多物面成像特性，提出一种实时三维激光荧光显微成像装置。通过倒置显微镜结构，从下面加入长焦深无衍射飞秒激光激发光，在荧光探测光路中加入扭曲达曼光栅实现多层物面同时成像于电子增强电荷耦合器件(EMCCD)相机的探测面上，从而实现了真正意义上的实时三维荧光显微成像。此外，通过一个可推进/退出式柱反射镜，可实现传统明场照明显微并通过目镜人眼观察和通过EMCCD探测的激光荧光显微两种工作模式的切换。本专利技术的技术解决方案如下：一种实时三维激光荧光显微成像装置，其特点在于该装置分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块，以及控制模块五个部分：所述的激光激发模块包括飞秒激光器，沿该飞秒激光器的激光输出的Y轴方向依次经过可调透过率的衰减片、物镜、小孔、消色差准直透镜，到达1：1分束镜，经过所述的1：1分束镜,其中50％激光经过90度反射，沿X轴负方向传播到达空间光调制器液晶面板；然后所述激光经过空间光调制器的液晶面板反射180度沿X轴方向传播，再次经所述1：1分束镜并且50％激光透过，然后依次经过偏振片、第一透镜、x方向扫描振镜、y方向扫描振镜、第二透镜、第三透镜、二向色性分光镜、平场消色差物镜、载物台，最终聚焦到样品上，所述的第一透镜和第二透镜组成共焦透镜组，第三透镜和平场消色差物镜组成另一组共焦透镜组，所述的载物台位于XYZ三维方向线型移动平台上；所述的明场照明模块包括白光发光二极管，沿该白光发光二极管的输出光方向依次是消色差准直透镜、聚光镜和所述的样品，所述的白光发光二极管位于所述的消色差准直透镜焦点处；所述的数字探测模块包括反射镜，在该反射镜焦点位置是一个可推进/退出的柱反射镜，当所述推进/退出的柱反射镜退出时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为荧光探测模式，此时所述的激发模块的激光照射到样品上经过二次谐波效应产生荧光，所述的荧光依次经过平场消色差物镜、二向色性分光镜，到达反射镜，所述荧光经过反射镜反射90度沿X轴方向传播，依次经过第四透镜、6位置滤光片轮组、第五透镜、可变光阑、扭曲达曼光栅，最后成像在电子增强电荷耦合元件相机的探测面上，所述的第四透镜和第五透镜组成共焦透镜组，所述的平场消色差物镜的主平面位于所述的第五透镜的前焦面上，所述的扭曲达曼光栅位于所述的第五透镜的后焦面上；所述的目镜观察模块包括可推进/退出的柱反射镜，当可推进/退出柱反射镜推进时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为目镜观察模式，此时明场照明模块中照射到样品上的照明光经过样品依次经过平场消色差物镜、二向色性分光镜、反射镜，然后经过所述的柱反射镜反射90度沿Z轴方向传播依次经过第六透镜、转向反射棱镜和目镜，所述的可推进/退出柱反射镜的反射镜面中心位于所述的第六透镜的前焦面上；此时所述的可推进/退出柱反射镜的反射镜面的中心位于所述的第四透镜的后焦点和第五透镜(404)的前焦点上；此时所述的第四透镜和所述的第六透镜也组成一对共焦透镜组；所述的控制模块包括工业控制计算机、空间光调制器控制器、移动平台控制器和XYZ三维方向线型移动平台，所述的工业控制计算机的输出端分别与所述的空间光调制器控制器、移动平台控制器和电子增强电荷耦合元件相机的输入端相连，所述的空间光调制器控制器的输出端与空间光调制器的液晶面板相连，所述的移动平台控制器的输出端与所述的XYZ三维方向线型移动平台的控制端相连。所述的空间光调制器液晶面板上加载的相位分布满足角锥相位分布，即其中为空间光调制器液晶面上的极坐标，坐标原点为液晶面中心；mod(f,2π)表示对函数f取除以2π的余数；k＝2π/λ为波数；λ为工作波长；α表示经过角锥相位发散角。所述的平场消色差聚焦物镜处产生的高斯-贝塞尔激发光束的工作距离dw的关系式满足其中，f3和f4分别为第三透镜和平场消色差物镜的焦距，f1和f2分别为第一透镜和第二透镜的焦距，D0为空间光调制器液晶面板上角锥相位的最大孔径；激发光所激发的荧光视场半径约为k＝2π/λ为波数，λ为工作波长；轴向焦深范围可以表示为其中τ为经过平场消色差物镜之后的光锥发散角，可以表示为此外，加载到空间光调制器上的角锥相位发散角α满足，其中Dobj为平场消色差物镜的通光孔径。所述的飞秒激光器的中心波长在范围690～1020纳米内可调谐，且通过物镜和准直透镜之后入射到空间光调制器液晶面板上的光束为高斯分布。所述的6位置滤光片轮组包含6个波段的荧光滤光片，中心波长分别对应450纳米、480纳米、510纳米、530纳米、570纳米，和610纳米，带宽均为正负10纳米。所述的载物台装载在一个XYZ三个方向可移动的三维移动平台上，且XYZ三维线型移动平台在三个维度上都装有绝对式光栅尺，可以实现由多个子视场拼接成一幅大视场图像。所述的转向反射棱镜的第一反射面是镀有一层银镜反射膜，第二反射面即入射面和出射面都镀有400～760宽带减反膜，且偏转角度θ满足关系式其中θth＝arcsin(1/n)，n为转向反射棱镜材料折射率。本专利技术的技术效果如下：本专利技术实时三维激光荧光显微成像装置，可实现生物样品的三维实时荧光显微成像。同时，该成像装置还兼容传统明场照明成像工作模式。附图说明图1是本专利技术实时三维激光荧光显微成像装置的原理示意图：101—飞秒激光器；102—可调透过率的衰减片；103—物镜；104—小孔；105—消色差准直透镜；106—1：1分束镜；107—空间光调制器液晶面板；108—偏振片；109—第一透镜；110—x方向扫描振镜；111—y方向扫描振镜；112—第二透镜；113—第三透镜；114—二向色性分光镜；115—平场消色差物镜；116—载物台；117—样品；201—白光发光二极管；202—消色差准直透镜；203—聚光本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于该装置分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块和控制模块五部分：所述的激光激发模块包括飞秒激光器(101)，沿该飞秒激光器(101)的激光输出的Y轴方向依次经过可调透过率的衰减片(102)、物镜(103)、小孔(104)、消色差准直透镜(105)，到达1：1分束镜(106)，经过所述的1：1分束镜(106)其中50％激光经过90度反射，沿X轴负方向传播到达空间光调制器液晶面板(107)；然后所述激光经过空间光调制器的液晶面板反射180度沿X轴方向传播，再次经所述1：1分束镜(106)并且50％激光透过，然后依次经过偏振片(108)、第一透镜(109)、x方向扫描振镜(110)、y方向扫描振镜(111)、第二透镜(112)、第三透镜(113)、二向色性分光镜(114)、平场消色差物镜(115)、载物台(116)，最终聚焦到样品(117)上，所述的第一透镜(109)和第二透镜(112)组成共焦透镜组，第三透镜(113)和平场消色差物镜(115)组成另一组共焦透镜组，所述的载物台(116)位于XYZ三维方向线型移动平台(004)上；所述的明场照明模块包括白光发光二极管(201)，沿该白光发光二极管(201)的输出光方向依次是消色差准直透镜(202)、聚光镜(203)和所述的样品(117)，所述的白光发光二极管(201)位于所述的消色差准直透镜(202)焦点处；所述的数字探测模块包括反射镜(401)，在该反射镜(401)的焦点位置是一个可推进/退出的柱反射镜(301)，当所述推进/退出的柱反射镜(301)退出时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为荧光探测模式，此时所述的激发模块的激光照射到样品(117)上经过二次谐波效应产生荧光，所述的荧光依次经过平场消色差物镜(115)、二向色性分光镜(114)，到达反射镜(401)，所述荧光经过反射镜(401)反射90度沿X轴方向传播，依次经过第四透镜(402)、6位置滤光片轮组(403)、第五透镜(404)、可变光阑(405)、扭曲达曼光栅(406)，最后成像在电子增强电荷耦合元件相机(407)的探测面上，所述的第四透镜(402)和第五透镜(404)组成共焦透镜组，所述的平场消色差物镜(115)的主平面位于所述的第五透镜(402)的前焦面上，所述的扭曲达曼光栅(406)位于所述的第五透镜(404)的后焦面上；所述的目镜观察模块包括可推进/退出的柱反射镜(301)，当可推进/退出柱反射镜(301)推进时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为目镜观察模式，此时明场照明模块中照射到样品(117)上的照明光经过样品依次经过平场消色差物镜(115)、二向色性分光镜(114)、反射镜(401)，然后经过所述的柱反射镜(301)反射90度沿Z轴方向传播依次经过第六透镜(302)、转向反射棱镜(303)和目镜(304)，所述的可推进/退出柱反射镜(301)的反射镜面中心位于所述的第六透镜(302)的前焦面上；此时所述的可推进/退出柱反射镜(301)的反射镜面的中心位于所述的第四透镜(402)的后焦点和第五透镜(404)的前焦点上；此时所述的第四透镜(402)和所述的第六透镜(302)也组成一对共焦透镜组；所述的控制模块包括工业控制计算机(001)、空间光调制器控制器(002)、移动平台控制器(003)和XYZ三维方向线型移动平台(004)，所述的工业控制计算机(001)的输出端分别与所述的空间光调制器控制器(002)、移动平台控制器(003)和电子增强电荷耦合元件相机(407)的输入端相连，所述的空间光调制器控制器(002)的输出端与空间光调制器的液晶面板(107)相连，所述的移动平台控制器(003)的输出端与所述的XYZ三维方向线型移动平台(004)的控制端相连。...
【技术特征摘要】
1.一种实时三维激光荧光显微成像装置，其特征在于该装置分为激光激发模块、明场成像照明模块、数字探测模块、目镜观察模块和控制模块五部分：所述的激光激发模块包括飞秒激光器(101)，沿该飞秒激光器(101)的激光输出的Y轴方向依次经过可调透过率的衰减片(102)、物镜(103)、小孔(104)、消色差准直透镜(105)，到达1：1分束镜(106)，经过所述的1：1分束镜(106)其中50％激光经过90度反射，沿X轴负方向传播到达空间光调制器液晶面板(107)；然后所述激光经过空间光调制器的液晶面板反射180度沿X轴方向传播，再次经所述1：1分束镜(106)并且50％激光透过，然后依次经过偏振片(108)、第一透镜(109)、x方向扫描振镜(110)、y方向扫描振镜(111)、第二透镜(112)、第三透镜(113)、二向色性分光镜(114)、平场消色差物镜(115)、载物台(116)，最终聚焦到样品(117)上，所述的第一透镜(109)和第二透镜(112)组成共焦透镜组，第三透镜(113)和平场消色差物镜(115)组成另一组共焦透镜组，所述的载物台(116)位于XYZ三维方向线型移动平台(004)上；所述的明场照明模块包括白光发光二极管(201)，沿该白光发光二极管(201)的输出光方向依次是消色差准直透镜(202)、聚光镜(203)和所述的样品(117)，所述的白光发光二极管(201)位于所述的消色差准直透镜(202)焦点处；所述的数字探测模块包括反射镜(401)，在该反射镜(401)的焦点位置是一个可推进/退出的柱反射镜(301)，当所述推进/退出的柱反射镜(301)退出时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为荧光探测模式，此时所述的激发模块的激光照射到样品(117)上经过二次谐波效应产生荧光，所述的荧光依次经过平场消色差物镜(115)、二向色性分光镜(114)，到达反射镜(401)，所述荧光经过反射镜(401)反射90度沿X轴方向传播，依次经过第四透镜(402)、6位置滤光片轮组(403)、第五透镜(404)、可变光阑(405)、扭曲达曼光栅(406)，最后成像在电子增强电荷耦合元件相机(407)的探测面上，所述的第四透镜(402)和第五透镜(404)组成共焦透镜组，所述的平场消色差物镜(115)的主平面位于所述的第五透镜(402)的前焦面上，所述的扭曲达曼光栅(406)位于所述的第五透镜(404)的后焦面上；所述的目镜观察模块包括可推进/退出的柱反射镜(301)，当可推进/退出柱反射镜(301)推进时，所述的实时三维激光荧光显微成像装置切换为目镜观察模式，此时明场照明模块中照射到样品(117)上的照明光经过样品依次经过平场消色差物镜(115)、二向色性分光镜(114)、反射镜(401)，然后经过所述的柱反射镜(301)反射90度沿Z轴方向传播依次经过第六透镜(302)、转向反射棱镜(303)和目镜(304)，所述的可推进/退出柱反射镜(301)的反射镜面中心位于所述的第六透镜(302)的前焦面上；此时所...
【专利技术属性】
技术研发人员：余俊杰，周常河，项长铖，吴俊，
申请(专利权)人：中国科学院上海光学精密机械研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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