一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，包括：光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器和用于荧光激发的第二激光器，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；二向色镜，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光并具有阵列分布的亮斑和暗斑；成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机。本发明专利技术还公开一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及光学超分辨显微领域，尤其涉及一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置。
技术介绍
超分辨荧光显微成像作为一种具备纳米尺度成像能力的技术，在活细胞蛋白动力学领域有着不可替代的作用，是揭示生命基本活动现象和规律的重要手段。但目前的超分辨技术，受限于各种原理及技术因素，在活细胞超分辨成像方面，仍显不足。目前，比较成功的超分辨荧光显微成像技术主要由以下几种：单分子荧光成像(PALM和STORM)，受激辐射损耗显微技术(STED)，结构光照明显微技术(SIM和SSIM)，荧光辐射微分超分辨显微技术(FED)。STED技术是将一束空心光斑叠加在一个高斯光斑上，抑制了高斯光斑四周的荧光辐射，进而实现了超分辨成像，可以在小视场范围内得到较高的时间分辨率和空间分辨率，同时具有较高的成像深度，PALM和STORM采用随机光照明成像的方式结合光斑中心定位算法来实现超分辨成像。但他们的缺点也很明显：需要很强的激发光来照明样品。通常地球上的生物体受到的太阳辐射在0.1W/cm2，而STED和PALM/STORM通常需要的辐射在103～108W/cm2，在这种情况下，荧光蛋白/分子很容易被漂白，产生大量的自由基损伤活细胞样品。另外，超分辨成像的核心在于ON-OFF，从这个角度来看，假设荧光光子数恒定，那么SIM成像的方法则是并行度最高的，最有效地利用荧光分子所发出的光子；也正因为并行度高，所以大大降低了其所需要的照明功率，在过去的几年里被证明成为活细胞超分辨率成像的利器。但目前的SIM技术只能突破衍射极限两倍，以561nm激发光，NA＝1.49 物镜为例，其横向分辨率只能达到约100nm左右，仍显不足。SSIM虽然可以通过增大照明光功率的办法，将横向分辨率提升至100nm以内，但不可避免的带来了光漂白的问题，使其很难应用于活细胞超分辨成像领域。因此，如何能够实现一种在不增加照明光功率的前提下，又可以达到100nm以内甚至更高的横向分辨率的结构光照明超分辨显微方法，将可以完美实现宽视场、超分辨、活细胞成像过程，具有重要的意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置，可以同时兼顾宽视场、超分辨、活细胞成像等需求，且横向分辨率比传统SIM和SSIM更高，很好的服务于生物、医学等领域。本专利技术的具体技术方案如下：一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，包括：光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器和用于荧光激发的第二激光器，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；二向色镜，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光，所述网格状结构照明光具有阵列分布的亮斑和暗斑；成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机。其中，所述的选频切换模块为声光可调谐滤波器，光源模块在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过声光可调谐滤波器进行选频切换，以输出不同的激光光束。优选的，所述的调制单元包括：位于光源模块出射光路上的第一二分之一波片和第一偏振分束立方体；位于第一偏振分束立方体透射光路上的第二二分之一波片和第二偏振分束立方体，所述第二偏振分束立方体出射 的第一p-偏振光和第一s-偏振光在所述二向色镜的表面产生水平干涉条纹；位于第一偏振分束立方体反射光路上的第三二分之一波片和第三偏振分束立方体，所述第三偏振分束立方体出射的第二p-偏振光和第二s-偏振光在所述二向色镜的表面产生垂直干涉条纹；所述的水平干涉条纹和垂直干涉条纹正交形成所述的网格状结构照明光。进一步的，所述第一s-偏振光的光路上依次设置有第一四分之一波片和第一反射镜，穿过第一四分之一波片的第一s-偏振光由第一反射镜反射后再次通过第一四分之一波片形成第三p-偏振光；所述的第三p-偏振光和第一p-偏振光经第四偏振分束立方体光路重叠后在所述二向色镜的表面产生水平干涉条纹；所述第二p-偏振光的光路上设置有第四二分之一波片，由第四二分之一波片出射为第三s-偏振光；所述第二s-偏振光的光路上依次设置有第二四分之一波片和第五反射镜，穿过第二四分之一波片的第二s-偏振光经第五反射镜反射后再次通过第二四分之一波片形成第四p-偏振光；所述的第三s-偏振光和第四p-偏振光经第四偏振分束立方体光路重叠后在所述二向色镜的表面产生垂直干涉条纹。优选的，所述的第一反射镜安装在第一压电陶瓷上，所述的第一压电陶瓷用于移动第一反射镜以改变干涉相位差；所述的第五反射镜安装在第二压电陶瓷上，所述的第二压电陶瓷用于移动第五反射镜以改变干涉相位差。本专利技术中，采用p-偏振和s-偏振光进行干涉产生网格状结构照明光，因此干涉调制对比度作为优选的，所述的汇聚模块具有沿二向色镜发射光路依次布置的镜筒透镜、第一四面体棱镜和活动安装的第二四面体棱镜，以使得聚焦至显微物镜后焦面处的四个光斑的相对位置可以调节，另外，在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过伺服电机带动第二四面体棱镜在光轴向前后移动，保持不同波长光源形成的干涉网格重合。为以保证从第二四面体棱镜射出的四束光的主轴均平行于z轴，优选的，所述第一四面体棱镜的楔角Φ为30度，所述第二四面体棱镜的楔角Φ为24度。优选的，所述的汇聚模块由伺服电机驱动并可绕光轴旋转。同时，利用上述的超分辨荧光显微装置，本专利技术还提供了一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法，具体步骤如下：1)由第一激光器发出激活光，在二向色镜处形成网格状结构激活光，并通过汇聚模块和显微物镜投射到样品上并激活荧光蛋白；2)由选频切换模块切换为第二激光器发出激发荧光，在二向色镜处形成网格状结构激活光，并光轴向移动第二四面体棱镜，使得通过汇聚模块和显微物镜投射到样品并形成与激活光相同的结构光照明，使激活的荧光蛋白发出的激发荧光，并采集荧光图像；3)利用激发光对样品进行宽场照明，淬灭剩余的激活荧光蛋白，使得整个样品上的荧光蛋白全部进入暗态；4)利用第一压电陶瓷和第二压电陶瓷改变网格状结构照明光的相位，重复步骤1)～步骤3)得到不同相位下的多幅荧光图像Dn(x)；5)驱动汇聚模块旋转45°，并利用第一压电陶瓷和第二压电陶瓷改变网格状结构照明光的相位，重复步骤1)～步骤3)得到不同相位下的多幅荧光图像6)根据被激活的荧光蛋白分布、激发光的数学模型以及所采集到的荧光图像构建线性方程，以此解出图像中重叠的频域分量；7)对重叠的频域分量进行重叠，得到最终的重构图像。在步骤2)中，激活的荧光蛋白分布为：其中，Iact(x)是激活光的空间分布，A[Iact(x)]是处于x处的荧光分子被激活光激活的相对概率；为激活光的峰值强度，i为虚数，为干涉对比度，或称之为调制深度，为激活光波矢，并有 λact为激活光波长，NA为显微物镜的数值孔径，为激活光相位；在步骤3)中，激发光的数学模型为：其中，Iexc(x)是激活光的空间分布，E[Iexc(x)]是处于x处的荧光分子被激发光激发的相对概率；为激活光的峰值强度，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，其特征在于，包括：光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器(1(a))和用于荧光激发的第二激光器(1(b))，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；二向色镜(26)，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光，所述网格状结构照明光具有阵列分布的亮斑和暗斑；成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块(27)，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜(29)，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机(31)。

【技术特征摘要】
1.一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，其特征在于，包括：光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器(1(a))和用于荧光激发的第二激光器(1(b))，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；二向色镜(26)，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光，所述网格状结构照明光具有阵列分布的亮斑和暗斑；成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块(27)，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜(29)，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机(31)。2.如权利要求1所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的选频切换模块为声光可调谐滤波器。3.如权利要求1所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的调制单元包括：位于光源模块出射光路上的第一二分之一波片(6)和第一偏振分束立方体(7)；位于第一偏振分束立方体(7)透射光路上的第二二分之一波片(8)和第二偏振分束立方体(11)，所述第二偏振分束立方体(11)出射的第一p-偏振光和第一s-偏振光在所述二向色镜(26)的表面产生水平干涉条纹；位于第一偏振分束立方体(7)反射光路上的第三二分之一波片(9)和第三偏振分束立方体(10)，所述第三偏振分束立方体(10)出射的第二p-偏振光和第二s-偏振光在所述二向色镜(26)的表面产生垂直干涉条纹；所述的水平干涉条纹和垂直干涉条纹正交形成所述的网格状结构照明光。4.如权利要求3所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述第一s-偏振光的光路上依次设置有第一四分之一波片(12)和第一反射镜(15)，穿过第一四分之一波片(12)的第一s-偏振光由第一反射镜(15)反射后再次通过第一四分之一波片(12)形成第三p-偏振光；所述的第三p-偏振光和第一p-偏振光经第四偏振分束立方体(23)光路重叠后在所述二向色镜(26)的表面产生水平干涉条纹；所述第二p-偏振光的光路上设置有第四二分之一波片(22)，由第四二分之一波片(22)出射为第三s-偏振光；所述第二s-偏振光的光路上依次设置有第二四分之一波片(13)和第五反射镜(14)，穿过第二四分之一波片(13)的第二s-偏振光经第五反射镜(14)反射后再次通过第二四分之一波片(13)形成第四p-偏振光；所述的第三s-偏振光和第四p-偏振光经第四偏振分束立方体(23)光路重叠后在所述二向色镜(26)的表面产生垂直干涉条纹。5.如权利要求4所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的第一反射镜(15)安装在第一压电陶瓷(25)上，所述的第一压电陶瓷(25)用于移动第一反射镜(15)以改变干涉相位差；所述的第五反射镜(14)安装在第二压电陶瓷(24)上，所述的第二压电陶瓷(24)用于移动第五反射镜(14)以改变干涉相位差。6.如权利要求1或5所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的汇聚模块(27)具有沿二向色镜(26)发射光路依次布置的镜筒透镜(35)、第一四面体棱镜(36)和活动安装的第二四面...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，陈友华，匡翠方，朱大钊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33