基于焦点调制的荧光显微系统及方法技术方案

本发明专利技术提供一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法，该荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；光源组件产生入射光束；光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；非调制光束通过聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至样品目标区域；光路调制组件为待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，调制光束进入所述初始显微光路，调制光束和非调制光束在成像物镜焦点处发生干涉；光电检测组件接收样品目标区域产生的光信号，并将光信号转换为电信号。本发明专利技术实施例可以提高荧光显微镜的纵向分辨率、信噪比及成像探测深度。

【技术实现步骤摘要】
基于焦点调制的荧光显微系统及方法
本专利技术涉及光学
，特别涉及一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法。
技术介绍
在活体生物组织的荧光成像
中，荧光显微镜(例如双光子显微镜)已成为一种必不可少的成像工具，与单光子技术相比，它最重要的一个优点是能够对厚生物组织样品进行三维成像。由于对散射生物组织样品具有亚细胞横向分辨率，双光子显微镜成为目前最受欢迎的显微技术之一。但是，双光子显微镜的纵向分辨率受光学成像限制较多，目前仅为2微米左右，无法纵向分辨更细微的生物组织样品。由于生物组织样品对入射光具有吸收、散射作用，随着探测深度的增加，激发光在焦点处的功率呈现指数衰减，信号减弱，在非焦点处的噪声增强，这使得成像信噪比(即焦点处的信号与非焦点处的噪声的比值)变差。经过某一特定探测深度后，噪声强度最终超过信号强度，此时再无法分辨信号和噪声，这个探测深度即为成像系统的极限成像深度。从这个角度讲，提高成像信噪比将是增加成像深度的关键。最近，出现了一些焦点调制技术，用于增加显微系统的分辨率和成像深度。其中一种是双光束焦点调制技术(Opt.Express,16(2008)18764)，被用于共聚焦显微系统上，该技术调制两D型光束的相对相位使其在物镜焦点处形成干涉，并通过提取焦点处与调制信号同相的信号作为焦点信号，以增加显微系统的分辨率和成像深度；另一种是脉冲时间聚焦调制技术(Proc.OfSPIE,8588(2013)858824)，该技术通过色散介质使脉冲光发生空间色散，使得仅在物镜的焦平面产生时间较短的脉冲光，而在焦平面的前部与后部得到时间展宽的脉冲，如此以来，入射光子只在焦平面处得到有效聚集，这使焦平面处的荧光强度达到最大。尽管如此，现有技术对纵向分辨率的提高仍非常有限，到目前为止还没有方法可通过做纵向焦点调制来提高纵向分辨率和增加成像深度。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法，该荧光显微系统通过纵向焦点调制提高成像深度和信噪比，并进一步改善空间分辨率。本专利技术实施例提供一种基于焦点调制的荧光显微系统，所述荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；其中，所述光源组件包含激光器，以产生照射至样品目标区域的光束；所述光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；所述聚光组件位于所述光路调制组件下游，从所述光路调制组件出射的所述非调制光束通过所述聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至所述样品目标区域；所述光路调制组件为所述待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且所述光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，所述待调制光束经所述光路调制组件后形成调制光束，该调制光束进入所述初始显微光路，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统的成像物镜焦点处发生干涉，通过周期性调制所述共轭光路的共轭位置而纵向调制照射至样品目标区域的光束在所述成像物镜焦点处的焦点；所述光电检测组件接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。一个实施例中，所述非调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第一焦点，所述调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第二焦点，所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；以及所述光电检测组件解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。一个实施例中，所述光路调制组件包括分光元件、第一反光元件和调制元件组；其中，所述分光元件将所述光束分离为所述非调制光束和所述待调制光束；所述第一反光元件用于使所述非调制光束直接进入所述初始显微光路；所述调制元件组用于对所述待调制光束进行调制形成周期性变化的所述调制光束，并使其进入所述初始显微光路；以及所述分光元件为分光片、光栅或三棱镜，所述第一反光元件为反光镜。一个实施例中，所述调制元件组包括共轭物镜、第二反光镜和压电陶瓷；其中，所述共轭物镜用于聚焦所述待调制光束；所述第二反光镜固定在沿所述共轭物镜的光轴方向周期扫动的所述压电陶瓷上，以反射调制后的所述待调制光束；以及所述调制光束经所述第二反光镜反射后，依次返回所述共轭物镜和所述分光元件后进入所述初始显微光路。一个实施例中，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述待调制光束经所述共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在所述第二反光镜上，所述第三焦点和所述第二焦点共轭，所述调制光束和非调制光束到达所述成像物镜焦点位置的光程相等。一个实施例中，所述聚光组件包括第三反光元件、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、二向色镜以及所述成像物镜；其中，所述非调制光束和所述调制光束分别经过所述第三反光元件反射后，依次经由所述第一聚焦透镜和所述第二聚焦透镜聚焦以被扩束，然后经过所述二向色镜进入所述成像物镜聚焦；所述第三反光元件为二维扫描振镜或可变形微反射镜阵列；以及所述第一焦点位于所述成像物镜的焦平面上。一个实施例中，所述光电检测组件包括第三聚焦透镜、光电倍增管及锁相放大器；其中，所述样品目标区域产生的光信号经过所述成像物镜收集后，经由所述二向色镜入射至所述第三聚焦透镜，所述光电倍增管接收通过所述第三聚焦透镜聚焦的所述光信号并将其转换为电信号，所述锁相放大器解调所述电信号以提取所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。本专利技术实施例还提供一种基于焦点调制的荧光显微方法，适用于荧光显微系统，所述荧光显微方法包括步骤：通过分光镜将照射至样品目标区域的入射光束分为非调制光束和待调制光束，所述非调制光束依次经过第一反光元件及所述分光镜反射后直接入射至初始显微光路；所述待调制光束入射至与所述初始显微光路共轭的共轭光路，形成周期性变化的调制光束，之后进入所述初始显微光路，入射到所述初始显微光路的成像物镜，且所述调制光束在所述成像物镜的后向孔径上的入射角周期性地变化，所述调制光束与所述非调制光束在所述成像物镜焦点处发生干涉，所述调制光束的焦点和非调制光束的焦点在纵向方向上周期性的重合与分离，使得所述样品目标区域产生荧光强度周期性变化的光信号；接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。一个实施例中，在所述荧光显微系统中，激光器产生所述入射光束；所述非调制光束和所述调制光束经所述成像物镜聚焦分别得到第一焦点和第二焦点，且所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；通过光电倍增管接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为所述电信号，并通过锁相放大器解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。一个实施例中，使所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动的步骤包括：使所述待调制光束由共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在第二反光镜上；及使所述第二反光镜随压电陶瓷沿所述第三焦点的光轴方向作周期扫动。一个实施例中，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统中经过的光程相等，且所述第三焦点与所述第二焦点共轭。本专利技术实施例对荧光显微系统进行了纵向焦点调制，并通过提取样品目标区域被入射光束(调制光束和非调制光束)照射时所产生的光信号，以提高荧光显微系统的分辨率和信噪比，从而可以增加成像系统的探测深度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；其中，所述光源组件包含激光器，以产生照射至样品目标区域的光束；所述光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；所述聚光组件位于所述光路调制组件下游，从所述光路调制组件出射的所述非调制光束通过所述聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至所述样品目标区域；所述光路调制组件为所述待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且所述光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，所述待调制光束经所述光路调制组件后形成调制光束，该调制光束进入所述初始显微光路，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统的成像物镜焦点处发生干涉，通过周期性调制所述共轭光路的共轭位置而纵向调制照射至样品目标区域的光束在所述成像物镜焦点处的焦点；所述光电检测组件接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。

【技术特征摘要】
1.一种基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；其中，所述光源组件包含激光器，以产生照射至样品目标区域的光束；所述光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；所述聚光组件位于所述光路调制组件下游，从所述光路调制组件出射的所述非调制光束通过所述聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至所述样品目标区域；所述光路调制组件为所述待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且所述光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，所述待调制光束经所述光路调制组件后形成调制光束，该调制光束进入所述初始显微光路，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统的成像物镜焦点处发生干涉，通过周期性调制所述共轭光路的共轭位置而纵向调制照射至样品目标区域的光束在所述成像物镜焦点处的焦点；所述光电检测组件接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号；所述非调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第一焦点，所述调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第二焦点，所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；以及所述光电检测组件解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。2.如权利要求1所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述光路调制组件包括分光元件、第一反光元件和调制元件组；其中，所述分光元件将所述光束分离为所述非调制光束和所述待调制光束；所述第一反光元件用于使所述非调制光束直接进入所述初始显微光路；所述调制元件组用于对所述待调制光束进行调制形成周期性变化的所述调制光束，并使其进入所述初始显微光路；以及所述分光元件为分光片、光栅或三棱镜，所述第一反光元件为反光镜。3.如权利要求2所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述调制元件组包括共轭物镜、第二反光镜和压电陶瓷；其中，所述共轭物镜用于聚焦所述待调制光束；所述第二反光镜固定在沿所述共轭物镜的光轴方向周期扫动的所述压电陶瓷上，以反射调制后的所述待调制光束；以及所述调制光束经所述第二反光镜反射后，依次返回所述共轭物镜和所述分光元件后进入所述初始显微光路。4.如权利要求3所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述待调制光束经所述共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在所述第二反光镜上，所述第三焦点和所述第二焦点共轭，所述调制光束和非调制光束到达所述成像物镜焦点位置的光程相等。5.如权利要求1所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述聚光组件包括第三反光元件、第一聚焦透镜、第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑炜，许强，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44