一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法技术

本发明专利技术涉及用于植物显微结构观察的荧光染色方法，可有效解决快速制片，对植物显微结构的观察问题，方法是，将植物材料切制成长宽各1‑5mm的小块或小段，将植物材料置于由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇中固定20‑40min，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10‑20min，由DMSO、Triton X‑100和荧光增白剂220制成染色液，在室温下染色10‑60min，然后用PBS缓冲液漂洗10‑15min，滴加DAPI溶液对细胞中核酸进行荧光染色，蒸馏水漂洗，再滴加甘油，加盖玻片，用激光共聚焦显微镜观察照相，本发明专利技术方法简单，无需切片机，制片时间短，可以观察到植物的三维构造，适用于各种植物的细胞或组织的观察，清晰、准确，成本低，效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物组织观察，特别是一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法。
技术介绍
显微技术是研究植物科学的重要手段，目前对植物细胞和组织显微结构的研究仍然以光学显微镜为主，使用的主要是石蜡切片和超薄切片技术，但是制片方法复杂，需要时间长，不能快速制片，并且对实验的操作要求较高，需要相应的切片机和其他设备，最终得到的是二维图像，限制了广泛使用。激光共聚焦显微镜能够对较厚、半透明甚至不透明的植物材料进行观察，能较为灵敏检测到荧光物质在细胞和组织中的分布，对细胞和组织进行无损伤的系列光学切片，得到各个层面的信息，经过电脑处理后可以得到其三维立体结构图像。植物整体装片和染色法可以在不破坏整体结构的条件下对样品进行处理，经过适当的荧光染料染色，结合激光共聚焦显微技术成为一种对植物材料进行快速制样与观察的手段。它不仅大大缩短样品准备所需时间，而且可以获得三维图象，在植物学研究中得到日益广泛的应用，但荧光染色如何应用于植物显微结构的观察上至今未见有行之有效方法的公开报导。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法，可有效解决快速制片，对植物显微结构的观察问题。本专利技术解决的技术方案是，由以下步骤实现：1.取材取植物材料，切制成长宽各1-5mm的小块或小段；所述的植物材料为花粉粒，胚囊、花柱、胚珠、叶片、根或茎；2.固定室温下，将植物材料置于由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇中固定20-40min；3.第一次漂洗从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-20min；4.染色将漂洗后的植物材料滴加由质量浓度1-3%的DMSO0.02-0.1ml（1-5滴，0.02ml/滴）、质量浓度0.02-0.2%的TritonX-1000.02-0.1ml（1-5滴，0.02ml/滴），0.05-0.2%的荧光增白剂2200.02-0.1ml（1-5滴，0.02ml/滴）制成的染色液，在室温下染色10-60min；5.第二次漂洗将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-15min；6.核酸染色二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.01-0.05%的DAPI溶液0.02-0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色10-20min；7.封片用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度10-20%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；8.观察用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。本专利技术方法简单，无需切片机，制片时间短，可以观察到植物的三维构造，适用于各种植物的细胞或组织的观察，清晰、准确，非常有利于对植物显微结构的分析研究，成本低，效果好，有良好的经济和社会效益。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。本专利技术在具体实施中，可由以下实施例给出。实施例1本专利技术在具体实施中，由以下步骤实现：1.取材取植物的花粉粒、胚囊、花柱或胚珠，或取叶片、根或茎切制成长宽各2-3mm的小块或小段；2.固定室温下，将植物材料置于装有由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇制成的固定液的玻璃容器中，固定25-35min，当固定叶片时，需用甲醇除去叶绿素，溶解角质层；3.第一次漂洗从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-18min；4.细胞壁染色将第一次漂洗后的植物材料放在双凹载玻片的圆凹中，滴加由质量浓度1.5-2.5%的DMSO0.03-0.05ml、质量浓度0.05-0.15%的TritonX-1000.03-0.05ml、质量浓度0.1-0.15%的荧光增白剂2200.03-0.05ml制成的染色液，在室温下染色20-50min；5.第二次漂洗将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-13min；6.核酸染色二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.02-0.04%的DAPI溶液0.03-0.05ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色12-18min；7.封片用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度12-18%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；8.观察用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。实施例2本专利技术在具体实施中，由以下步骤实现：1.取材取植物的花粉粒、胚囊、花柱或胚珠，或取叶片、根或茎切制成长宽各1-5mm的小块或小段；2.固定室温下，将植物材料置于装有由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇制成的固定液的玻璃容器中，固定30min，当固定叶片时，需用甲醇除去叶绿素，溶解角质层；3.第一次漂洗从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗15min；4.细胞壁染色将第一次漂洗后的植物材料放在双凹载玻片的圆凹中，滴加由质量浓度2%的DMSO0.06ml、质量浓度0.11%的TritonX-1000.06ml、质量浓度0.12%的荧光增白剂2200.06ml制成的染色液，在室温下染色35min；5.第二次漂洗将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10min；6.核酸染色二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.03%的DAPI溶液0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色15min；7.封片用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度15%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；8.观察用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。本专利技术方法经多次反复试用和实验表明，经过透明处理和荧光染色后，细胞壁和细胞核经过荧光激后可以显示较强的荧光，在观察胚囊时，胚囊中的各个细胞往往不在一个光学切面上，利用激光共聚焦显微镜的逐层扫描功能，扫描图像经过计算机三维重建后，可以得到样品的三维重建结构，可以清晰观察胚囊内各细胞的结构和空间分布情况，整体感强。荧光增白剂220能够作用于β-1,4葡聚糖和β-1,3葡聚糖，渗透性好，低浓度下也能对细胞壁和花粉管取得均一的染色效果，染料本身荧光弱，即使漂洗后有残余染料，在材料在染料中也能观察到细胞壁和花粉管的强烈荧光。在对花粉管染色时，由于荧光增白剂220和花粉管结合显示比细胞壁更为明亮的荧光，因此可以很容易识别花粉管。DNA荧光染色过去多用PI(碘化丙啶），PI渗透性差，染色均一性差。DAPI为一种非常优秀的荧光染料，无论固定过和没有固定过的活细胞均可以用DAPI染色，渗透性好，染色均一。可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合，产生壁DAPI自身强20多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：1）.取材取植物材料，切制成长宽各1‑5mm的小块或小段；所述的植物材料为花粉粒，胚囊、花柱、胚珠、叶片、根或茎；2）.固定室温下，将植物材料置于由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇中固定20‑40min；3）.第一次漂洗从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10‑20min；4）.染色将漂洗后的植物材料滴加由质量浓度1‑3%的DMSO 0.02‑0.1ml、质量浓度0.02‑0.2%的Triton X‑100 0.02‑0.1ml，0.05‑0.2%的荧光增白剂220 0.02‑0.1ml制成的染色液，在室温下染色10‑60min；5）.第二次漂洗将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10‑15min；6）.核酸染色二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.01‑0.05%的DAPI溶液0.02‑0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色10‑20min；7）.封片用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度10‑20%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；8）.观察用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。...

【技术特征摘要】
1.一种用于植物显微结构观察的荧光染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）.取材
取植物材料，切制成长宽各1-5mm的小块或小段；
所述的植物材料为花粉粒，胚囊、花柱、胚珠、叶片、根或茎；
2）.固定
室温下，将植物材料置于由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇中固定20-40min；
3）.第一次漂洗
从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-20min；
4）.染色
将漂洗后的植物材料滴加由质量浓度1-3%的DMSO0.02-0.1ml、质量浓度0.02-0.2%的TritonX-1000.02-0.1ml，0.05-0.2%的荧光增白剂2200.02-0.1ml制成的染色液，在室温下染色10-60min；
5）.第二次漂洗
将染色后的植物材料取出，放在载玻片上，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗10-15min；
6）.核酸染色
二次漂洗后的植物材料滴加质量浓度0.01-0.05%的DAPI溶液0.02-0.06ml，室温下，对细胞中核酸进行荧光染色10-20min；
7）.封片
用蒸馏水漂洗，除去表面的染色液，再滴加质量浓度10-20%的甘油，将植物材料表面覆盖，加盖玻片；
8）.观察
用激光共聚焦显微镜观察照相，实现对植物显微结构的观察。
2.根据权利要求1所述的用于植物显微结构观察的荧光染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）.取材
取植物的花粉粒、胚囊、花柱或胚珠，或取叶片、根或茎切制成长宽各2-3mm的小块或小段；
2）.固定
室温下，将植物材料置于装有由pH8.0的PBS缓冲液配置成的质量浓度4%的多聚甲醛或甲醇制成的固定液的玻璃容器中，固定25-35min，当固定叶片时，用甲醇除去叶绿素，溶解角质层；
3）.第一次漂洗
从固定液中取出植物材料，用pH8.0的PBS缓冲液漂洗12-18min；
4）.细胞壁染色
将第一次漂洗后的植物材料放在双凹载玻片的圆凹中，滴加由质量浓度1.5-2.5%的DMSO的0.03-0.05ml、质量浓度0.05-0....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘孟奇，王小巧，赵乐，罗晓，代丽萍，陈随清，
申请(专利权)人：河南中医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41