荧光焦点调制显微系统和方法技术方案

公开一种荧光焦点调制显微系统（１０）和方法（２００），以便对具有单光子激发荧光的厚生物组织（１４０）进行高分辨率分子成像。通过使用焦点调制，即用于抑制由散射光激发的背景荧光信号的技术，对于多散射介质内的成像，保持光学层析和衍射有限空间分辨率。焦点调制显微系统具有插入在激发光路（３４）中的空间相位调制器（１８），该空间相位调制器以预定频率周期性地改变焦点体积周围的相干激发光的空间分布。用解调的荧光在显示器（１１４）上形成荧光焦点调制图像（１２２，１４２），然而共焦图像（１２０，１４０）同时是可变的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体地涉及光学显微镜，更具体地涉及荧光共焦光学显微系统和方法。
技术介绍
已经开发多种光学显微镜，并且在现代生物研究和临床诊断中已经使用了这些光学显微镜。常常需要这些光学显微镜来观察细胞及其亚细胞结构。作为现代细胞生物学的 起源，在300多年以前开始发现了细胞，这是专利技术显微镜的直接结果。传统的光显微镜具有 非常有限的成像深度。仅有表面显微结构能够被观察，或者需要将样品机械地分割为非常 薄的切片(slice)。作为光学层析能力(optical sectioningcapability)的结果，如美国 专利No. 3013467中所描述的共焦显微术的专利技术导致成像深度的飞跃。用生物组织可以实 现至多200微米的穿透深度(penetration depth)。共焦显微镜通常用荧光染料工作，以提 供分子敏感性(sensitivity)和特异性。通过使用荧光分子的多光子激发，成像深度可以 进一步被提高到大约700微米。然而，多光子显微镜需要使用昂贵的脉冲激光器。另外，脉 冲激光输出可以对活体细胞产生非线性光子诱导破坏，对于人体的应用尤其不希望这样。从微观尺度到宏观尺度，生物组织是非均质的(heterogeneous)。通常，由于光子 经受强散射和吸收，所以这些生物组织似乎对于可见光和近红外光不透明。散射，尤其是 多次散射，在改变光子的传播方向的成像科学中是不希望的现象。妨碍共焦显微镜看见生 物组织内的更深处的主要问题是多次散射。可以扩散到焦点体积(focal volume)的从焦 点区域发出的荧光不能被共焦针孔(confocal pinhole)充分地拒斥，从而有助于背景信 号。信号背景比(signal to background ratio)和空间分辨率随着深度增加而快速地劣 化。散射平均值自由程/s，即连续的散射事件之间的平均距离，在人的软组织中的典型值 为大约100微米。虽然传统的宽场显微术仅仅能够处理非常薄的样品，但是由于提供光学 层析能力，所以共焦显微术的专利技术在现代光显微术中是一个显著的进步。在共焦显微镜中， 用聚焦的光束照射样品，对样品逐点进行扫描，并且通过使用共焦针孔，将检测系统聚焦到 样品中的同一区域。在理想的情况中，在收集来自焦点的信号的同时，来自样品的离焦光 (out-of-focus light)大部分地被拒斥。然而，在焦点移动到样品中的散射光子占弹道光 子(ballistic photon)中的主导的这样深度时，这种选择检测机制不是如此有效。确定空 间分辨率的点扩展函数随着成像深度的增加而在空间中快速地扩宽。虽然在几个/s的深 度可以检测到强目标，但是即使在目标位于离表面的仅一个/s处时，通过背景信号也可以 容易地掩盖高分辨率细节。通常用共焦显微镜在几十个微米的最大成像深度处执行亚细胞 成像。在多光子显微术中，在小于1皮秒的超短时间窗内将聚焦的照明光束进一步会 聚。非线性吸收率在离焦时急剧地衰减，并且，在成像深度小于Imm时，这种选择激发方法 是有效的。作为提高了的成像深度和局部化的光化学(localized photochemistry)的结 果，多光子显微术已经日益成为对共焦显微术的流行的另一种选择。然而，多光子显微术是 使用超短脉冲的激光源的非常昂贵的技术。另外，在下述一些情况中单光子激发优于多光子激发其中，非线性光子破坏、荧光探针的可用性、组织自发荧光背景和图像获取速度备 受关注。光学相干X线体层照相术(tomography)是能够提供高分辨率结构图像的相对较 新的成像技术。使用相干光栅来分解(resolve)来自不同深度的信号。由于多次散射光 子的相干性质在散射后丧失了，所以来自多次散射光子的贡献被严重地抑制。用这种技术 可以轻易地实现几个毫米的成像深度。该技术在视网膜前段成像(retinal andanterior segment imaging)中的应用已经被商业化。对该技术在下述领域中的潜在的应用正在进行 积极的研究组织工程产品表征、血管评价、皮肤癌诊断和用于肠胃(GI)跟踪的癌症检测。 不幸的，光学相干X线体层照相术的对比机制是基于背散射，并且与荧光不兼容。很多研究 组一直试图将诸如吸收和第二谐振产生的其它分子特定技术与光学相干X线体层照相术 连接起来。然而，除了其它限制以外，空间分辨率通常与这些组合严格地妥协。光学相干X 线体层照相术中的相干光栅机制在拾取期望的信号方面是非常有效的。虽然多次散射的光 中的一些仍然到达光电检测器，但是具有很好限定的光程长和偏振状态的背散射、散射一 次或反射的光产生用于图像形成的条纹信号。近来用傅立叶域技术进一步提高了成像深度 和速度。不幸的，光学相干X线体层照相术与荧光不兼容。虽然光学相干X线体层照相术 已经成功地应用到对人眼和中空器官的精细结构的可视化，但是其分子成像能力是相当有 限的。因此，需要一种解决上述缺陷或者至少减轻上面对传统的光学 显微镜讨论的问题 的光学显微镜。特别地，需要保持较深区域中的近衍射限制分辨率并开发有效地防止与图 像形成有关的多次散射光子的机制。
技术实现思路
本专利技术的一个方面提供一种荧光焦点调制显微系统，该荧光焦点调制显微系统包 括光源组件，用于产生光束并照射样品的目标区域；空间相位调制器，被布置在光束的路 径中并将光束分离为第一光束和第二光束，第一光束与第二光束平行并与第二光束在空间 上分离，第二光束被调制有与第一光束不同的相位延迟；聚焦组件，接收第一光束和第二光 束并照射样品的目标区域；以及光电检测器组件，用于接收从样品的照射目标区域发射的 发光信号，并且将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电 信号。在实施例中，该系统还包括处理器和显示器，处理器基于接收光电信号并根据交 流分量的交流振幅和直流分量的直流幅度之和计算最大发射强度，处理显示器上的图像， 并且/或者，处理器基于接收光电信号和将图像基于光电信号的交流分量，处理显示器上 的图像。空间相位调制器可以包括波长扫描源和差分延迟线，并且，波长扫描源可以被布 置为在光路中以预定的差重复地扫动光源的波长。空间相位调制器可以包括第一反射镜 和第二反射镜，第二反射镜可相对于第一反射镜移动，以相对于第一光束调制第二光束，其 中，第二反射镜可以被安装在压电致动器上，并且第一光束和第二光束之间的相对相移取 决于施加到压电致动器的电压。空间相位调制器可以沿着从光源产生的光束的路径和从 样品的照射目标区域发射的光的路径布置。聚焦组件可以包括二向色镜和物镜，并且，空间相位调制器可以沿着光束的路径布置在二向色镜的上游或下游。该系统还可以包括扫 描组件，用于相对于样品扫描第一光束和第二光束，其中，扫描组件可以包括转向反射镜 (steering mirror)，用于相对于样品扫描第一光束和第二光束，并且/或者，扫描组件包括 用于保持样品的保持器或可移动载物台(movable stage)和用于相对于第一光束和第二光 束可移动地扫描样品的致动器。该系统还可以包括在从样品的照射目标区域发射的发光信 号的路径中的光阑，以防止从样品的非目标区域发射的光到达光电检测器，其中，光阑可以 是，例如，针孔、狭缝、长通滤波器、光缆等。光源可以被布置用于单光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光焦点调制显微系统，包括：光源组件，用于产生光束并照射样品的目标区域；空间相位调制器，被布置在光束的路径中并将光束分离为第一光束和第二光束，第一光束与第二光束平行并与第二光束在空间上分离，第二光束被调制有与第一光束不同的相位延迟；聚焦组件，接收第一光束和第二光束并照射样品的目标区域；以及光电检测器组件，用于接收从样品的照射目标区域发射的发光信号，并且将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：NG陈，C谢泼德，CH翁，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]