一种贝叶斯显微成像方法技术

本发明专利技术涉及一种贝叶斯显微成像方法，包括以下内容：1)提取单分子信息提取，并获取单分子候选点；2)随机从单分子候选点中选择部分点作为初始点，建立用于构建不同位置荧光分子出现概率分布图的初始模型；3)采用聚类分析方法将初始模型中的荧光分子按位置信息进行聚类，对每一类荧光分子进行优化处理得到扩展点；4)从候选点中删除已经分析过的荧光分子，并从步骤2)中剩下的候选点随机选择建立初始模型，重复步骤3)得到新的扩展点，直到所有的候选点分析完成；5)合并所有的扩展点作为新的候选点重复步骤3)和步骤4)，直到相邻两次迭代重构结果满足设定要求，迭代停止；6)将迭代过程中得到的荧光分子位置信息进行重构，得到超高分辨率荧光分子的定位图。本发明专利技术广泛适用于大视野的活细胞及固定细胞的荧光显微成像。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种贝叶斯显微成像方法，属于生物超高分辨显微成像

技术介绍
超高分辨率荧光显微镜在生物学研究领域有着广泛的应用，使得人们能够更好、更深入地认识、理解细胞生物学。与电子显微镜一样，超高分辨率荧光显微镜可以让人们观察到以往无法观察到的细胞内部结构及动态变化过程。并且，超高分辨率荧光显微镜还具有连电子显微镜都无可比拟的优势—对活细胞成像，并能高特异性地标记多个分子。由于光学衍射的限制，传统的光学显微镜不能识别200nm以下的结构。超高分辨率荧光显微技术打破了这一限制，并在2014年获得诺贝尔化学奖，该技术主要可以分为两类，结构光照明技术(例如受激发射损耗显微技术STED和饱和结构照明显微技术SIM)和单分子荧光定位技术(例如随机光学重构显微技术STORM和光激活定位显微技术PALM)。其中，单分子定位技术通过大量具有稀疏荧光分子的图像拟合叠加得到超高分辨率图像，但是该方法要求图像中的荧光分子密度足够低以保证单个荧光分子之间不能重叠。为了获得超高分辨率图像就需要大量的图像，这样长时间拍照就会导致样品漂移和细胞损伤，时间分辨率低，影响该技术在活细胞成像中的应用。针对活细胞成像要求，当前有很多方法通过拟合多个荧光分子来得到更高时间分辨率的结果。但是，随着荧光密度的增加，很难确定真实的拟合模型，定位精度大大下降，这限制了时间分辨率的进一步提高。近年来，研究发现一种利用统计贝叶斯解决高密度荧光图像识别的方法(Bayesian analysisof the blinking and bleaching，3B)，3B利用荧光分子漂白和闪烁的特性，通过分析整个图像序列的变化得到荧光分子概率图。作为细胞成像新的重要工具，尽管它可以用简单的光学设备实现活细胞动态结构的超高分辨率成像，但是仍然有三个关键的问题需要解决：1)在精度方面，存在严重的结构缺失，定位精度不高；2)在速度方面，该方法极其耗时，为了得到1.5μm×1.5μm的超分辨率结构，大约需要6小时，并且随着图像尺寸的增加，计算时间急剧增长；3)在分析尺度方面，由于速度的限制，该方法很难获得整个活细胞大尺度长时间的动态变化。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的其中一个专利技术目的是提供一种能够加快高密度数据重构速度且能够提高重构精度的贝叶斯显微成像方法。本专利技术的另一专利技术目的是提供一种基于单分子定位的贝叶斯显微成像方法，能够确定细胞等生物样品中用来标记蛋白等生物物质的荧光分子在纳米尺度的精确定位，以及在活细胞中精确定位动态变化即活细胞中的超高分辨显微成像。为实现上述其中一专利技术目的，本专利技术采取以下技术方案：一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于包括以下内容：1)建立用于构建不同位置荧光分子出现概率分布图的初始模型；2)采用聚类分析方法、限定的前向算法和共轭梯度法优化初始模型并进行模型选择；3)重复步骤2)直到相邻两次迭代重构结果符合设定要求；4)将每次迭代过程中得到的荧光分子位置信息进行重构，得到荧光分子的超分辨定位图。进一步，所述步骤1)初始模型建立的具体过程为：连续采集一系列荧光图像作为原始图像序列；利用荧光分子的转移概率，随机选择分析区域中的某些位置作为初始位置，并在初始位置处建立因子隐马尔可夫初始模型。进一步，所述步骤2)优化初始模型的具体过程为：采用聚类分析方法对初始模型中荧光分子按照彼此相对距离的不同划分成N个不同的类别；以每一个类别中的初始位置出发，采用混合MCMC和限定的前向算法计算某一位置出现荧光分子的概率；采用共轭梯度法计算出现荧光分子概率的极值点，选取概率最高的位置作为优化结果，合并N个类别，并在获得概率最高的位置建立新的隐马尔可夫初始模型。进一步，所述步骤2)模型选择的具体过程为：①采用聚类分析方法对得到的新的初始模型中的荧光分子位置按照彼此相对距离的不同进行聚类分析，将其分为不同的类别；②随机选择某个位置作为待新增的荧光分子位置或者在新的初始模型中随机选择待删除荧光分子；③判断步骤②新增或删除的荧光分子与步骤①聚类后哪一个类别最近，在其最近或所属的类别中，使用混合MCMC、限定的前向算法和共轭梯度法计算在此位置增加一个荧光分子或删除一个已有荧光分子后对模型概率的影响，如果概率增加则保留该位置信息，并将其加入到新的初始模型作为新的初始位置。为实现上述另一专利技术目的，本专利技术采取以下技术方案：一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于包括以下内容：1)提取单分子信息提取，并获取单分子候选点；2)随机从单分子候选点中选择部分点作为初始点，建立用于构建不同位置荧光分子出现概率分布图的初始模型；3)采用聚类分析方法将初始模型中的荧光分子按位置信息进行聚类，对每一类荧光分子进行优化处理得到扩展点；4)从候选点中删除已经分析过的荧光分子，并从步骤2)中剩下的候选点随机选择建立初始模型，重复步骤3)得到新的扩展点，直到所有的候选点分析完成；5)合并所有的扩展点作为新的候选点重复步骤3)和步骤4)，直到相邻两次迭代重构结果满足设定要求，迭代停止；6)将迭代过程中得到的荧光分子位置信息进行重构，得到超高分辨率荧光分子的定位图。进一步，所述步骤1)提取单分子信息提取，并获取单分子候选点通过双通道荧光显微镜采集两通道采集单分子和高密度信息，或者通过单通道同时采集单分子和高密度信息。进一步，所述步骤1)提取单分子信息提取，并获取单分子候选点，具体过程为：1.1)对于提供单分子信息的图像序列，利用单分子定位方法，精确得到荧光分子的位置信息；1.2)当采用双通道进行数据采集时，在其中一通道图像序列中选择与待分析另一通道图像序列相同图像帧数所包含的单分子作为候选点；当采用单通道进行数据采集时，选择所有图像序列中的单分子作为候选点；1.3)当采用双通道进行数据采集时需要进行漂移校准：分别校准两通道的图像数据，并将两通道之间建立联系，将其中一通道图像的单分子候选点校准到待分析另一通道对应区域中。进一步，所述步骤3)采用聚类分析方法将初始模型中的荧光分子按位置信息进行聚类，对每一类荧光分子进行优化处理得到扩展点，包括以下内容：3.1)用混合前向算法和MCMC方法获得初始模型的采样图；3.2)对类中的每一个荧光分子，用限定的前向算法和改进的共轭梯度方法进行优化获得新的荧光分子；3.3)对每个新的荧光分子通过距离和强度阈值进行判断，确定是否将计算得到的新的荧光分子作为扩展点；3.4)计算扩展点的采样图，并将这些采样图通过扩张采样方法添加到初始模型的采样图中。进一步，限定的前向算法是指当计算某个荧光分子的观测概率时，不需要计算整个图像区域，而仅仅计算以该荧光分子中心坐标为中心，3个标准差的范围内的值，当超过该范围时，认为不会影响周围的荧光分子。进一步，所述聚类分析方法采用k-means方法。由于本专利技术采取以上技术方案，其具有以下优点：1、在时间分辨率方面，本专利技术与单分子定位标准方法PALM相比，时间分辨率提高100～1000倍，与高密度定位显微3B相比，重构需要图像帧数从至少200帧降低到100帧，时间分辨率提高两倍；在空间分辨率方面，本专利技术与PALM相比，重构结构基本相同；与3B相比，结构连续性更好，不会出现结构的缺失，定位精度高；在运行速度方面，相比3B有几个数量级的提高，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于包括以下内容：1)建立用于构建不同位置荧光分子出现概率分布图的初始模型；2)采用聚类分析方法、限定的前向算法和共轭梯度法优化初始模型并进行模型选择；3)重复步骤2)直到相邻两次迭代重构结果符合设定要求；4)将每次迭代过程中得到的荧光分子位置信息进行重构，得到荧光分子的超分辨定位图。

【技术特征摘要】
1.一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于包括以下内容：1)建立用于构建不同位置荧光分子出现概率分布图的初始模型；2)采用聚类分析方法、限定的前向算法和共轭梯度法优化初始模型并进行模型选择；3)重复步骤2)直到相邻两次迭代重构结果符合设定要求；4)将每次迭代过程中得到的荧光分子位置信息进行重构，得到荧光分子的超分辨定位图。2.如权利要求1所述的一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于，所述步骤1)初始模型建立的具体过程为：连续采集一系列荧光图像作为原始图像序列；利用荧光分子的转移概率，随机选择分析区域中的某些位置作为初始位置，并在初始位置处建立因子隐马尔可夫初始模型。3.如权利要求1所述的一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于，所述步骤2)优化初始模型的具体过程为：采用聚类分析方法对初始模型中荧光分子按照彼此相对距离的不同划分成N个不同的类别；以每一个类别中的初始位置出发，采用混合MCMC和限定的前向算法计算某一位置出现荧光分子的概率；采用共轭梯度法计算出现荧光分子概率的极值点，选取概率最高的位置作为优化结果，合并N个类别，并在获得概率最高的位置建立新的隐马尔可夫初始模型。4.如权利要求3所述的一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于，所述步骤2)模型选择的具体过程为：①采用聚类分析方法对得到的新的初始模型中的荧光分子位置按照彼此相对距离的不同进行聚类分析，将其分为不同的类别；②随机选择某个位置作为待新增的荧光分子位置或者在新的初始模型中随机选择待删除荧光分子；③判断步骤②新增或删除的荧光分子与步骤①聚类后哪一个类别最近，在其最近或所属的类别中，使用混合MCMC、限定的前向算法和共轭梯度法计算在此位置增加一个荧光分子或删除一个已有荧光分子后对模型概率的影响，如果概率增加则保留该位置信息，并将其加入到新的初始模型作为新的初始位置。5.一种贝叶斯显微成像方法，其特征在于包括以下内容：1)提取单分子信息提取，并获取单分子候选点；2)随机从单分子候选点中选择部分点作为初始点，建立用于构建不同位置荧光分
\t子出现概率分布图的初始模型；3)采用聚类分析方法将初始模型中的荧光分子按位置信息进行聚类，对每一类荧光分子进行优化处理得到扩展点；4)从候选点中删除已经分析过的荧光分子，并从步骤2)中剩下的候选...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐平勇，张法，徐帆，张名姝，贺文婷，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，中国科学院计算技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11