本发明专利技术提供了构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体。该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能插入外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动插入的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，其还携带有两端带有同源序列的自删除标记基因系统。其序列为SEQ ID No.1。利用本发明专利技术中的穿梭质粒，可以方便快捷的构建出表达外源目的基因但不带有筛选标记基因的重组MVA病毒。利用本发明专利技术中的质粒载体构建的重组MVA病毒，能够满足未来临床试验的需求。为以MVA为基础的活病毒载体疫苗的研发奠定了前期基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及在基于痘苗病毒高度减毒毒株MVA的活载体疫苗 的构建中，一种穿梭质粒的设计与应用，特别涉及一种构建重组MVA病毒的带有标记基因 自删除系统的穿梭载体。
技术介绍
MVA(modified vaccinia virus Ankara改良型痕苗病毒安卡拉株）是高度减毒的 痘苗病毒毒株，是在人类寻求高度减毒的痘苗病毒作为天花疫苗的过程中获得的。来源于 一个土耳其的痕苗病毒毒株 CVA (chorioallantois vaccinia virus Ankara)。CVA 在鸡成 纤维细胞中传代371代后，发现其生长特性已经发生了改变，在传代516代后改名为MVA。 与CVA相比，在鸡成纤维细胞中传代570代以后，MVA失去了在绝大部分哺乳动物细胞中感 染和复制的能力。分析基因图谱发现，在传代的过程中MVA丢失了大约30KB的病毒基因，这 些基因大多与病毒的毒力和宿主选择范围密切相关。在体外研宄中发现，当痘苗病毒感染 细胞后，早期基因转录导致病毒DNA复制，之后调苄基因和晚期基因表达。继而，病毒DNA被 包装到不成熟的蛋白粒子中成为有感染性的细胞内成熟的粒子。MVA在允许细胞（BHK-21， CEF等）内可以完成完整的生活周期，而在非允许细胞中，停止在了这个过程的某个步骤之 中。在人细胞内，MVA起始了复制，但是不能繁殖生长而产生有感染性的成熟颗粒，从而使 之具有了良好的安全性。 MVA作为活载体疫苗的载体具有以下几点优势：（I)MVA在传代过程中丢失了六个 主要的基因，在这六个删除基因的部位可以用来插入外源基因，并且在外源基因插入后并 不影响病毒本身的感染能力和表达能力。（2)免疫原性高。外源蛋白基因在被病毒载体递 送到体内后，基因被忠实表达，并且能够进行正确的转录、翻译和翻译后的加工与修饰。表 达的蛋白具有天然的构象与生物活性。较蛋白疫苗相比，能够诱导机体产生强而持久的体 液免疫和细胞免疫应答。（3)MVA作为天花疫苗，在上个世纪七十年代，在消灭天花的战役 中，成功的用于预防天花。并且已经对超过120000人进行了免疫，这些接受MVA接种的人群 只有小部分人有轻度的与之相关的副反应发生（如：红肿、发热和流感样症状）。MVA已经 在动物模型和人体试验中得到了很好的安全性评价，没有引发任何的由于接种引起的严重 临床疾病。总的来说，MVA稳定性好，安全性高，并且能表达大的外源蛋白。MVA可以模仿病 毒感染，产生适当的危险信号，并且诱导强而持久的细胞免疫应答。这种复制缺陷的病毒提 供了灭活疫苗的特性但是却有活疫苗的免疫原性，使之成为活载体疫苗的重要候选病毒。 目前以MVA为活病毒载体正在进行临床研宄的主要是由四种病原物质引起的感 染性疾病和肿瘤，分别是：HIV，HCV，HPV和结核分枝杆菌。到2012年底，以针对HIV感染的 MVA为活载体的疫苗大约有10个分别进入I期或II期临床研宄。针对HPV引起的子宫颈 癌的治疗的MVA活载体疫苗有2个进入了 II期临床研宄。针对HCV感染的MVA活载体疫 苗有两个已经进行到II期临床研宄，此外还有一个针对HBV感染的MVA疫苗进入了 IIa期 临床研宄，一个结核杆菌的MVA疫苗进入了 I期临床。 鉴于此，快速准确的构建携带有外源目标基因的MVA病毒成为病毒载体疫苗的各 项工作的首要任务。MVA基因组庞大，外援基因的引入主要依靠病毒基因组与携带有外源目 标基因的穿梭载体之间的随机同源重组来完成。穿梭载体在与MVA基因组发生同源重组获 得重组MVA病毒后，随同目的基因转入载体的还有标记基因。利用标记基因可以从大量非 转化细胞中将阳性重组克隆筛选出来。但随着重组病毒的传代，标记基因变得不再用，却仍 在细胞内表达。这些基因一旦进入机体，对机体的影响很难确定，产生安全性隐患。同时也 是在今后药品报批等过程中所不允许的。因此，构建带有标记基因自删除系统的穿梭质粒， 在痘苗病毒MVA的应用中的基础与关键。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种构建重组MVA病毒 的带有标记基因自删除系统的穿梭载体，该穿梭质粒载体，带有标记基因自删除系统的同 时又能转染和表达外源基因。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案为： 构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体，该穿梭载体携带有痘 苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能插入外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及 启动插入的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7. 5,还携带有两端带有同源序列的自 删除标记基因系统。 进一步的，所述自删除标记基因系统包括标记基因启动子：痘苗病毒启动子Pll， 标记基因 EGFP，以及两者外侧的同源序列。 进一步的，该穿梭载体还携带有抗性筛选标记基因。 进一步的，该抗性筛选标记基因为用于穿梭质粒载体在大肠杆菌中的氨苄抗性筛 选。 进一步的，其序列为SEQ ID No. 1。该重组载体以EGFP基因为起始，1-721位为 EGFP基因序列，722-850为EGFP基因的启动子Pl 1，第850-1267位为TKL'序列，1267-1529 为启动多克隆位点中插入的外源序列的启动子P7. 5。1530-1595为具有BamHI、Sail、BglI、 Apnl、Kpnl、Notl、EcoRI七个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点（MCS)。第1596-2532 位为TKR序列，第2533-5161位为与质粒复制与抗性（氨苄抗性）相关的基因序列。第 5162-5897 位为 TKL 序列。 一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体的方法，包括如下 步骤： 步骤一：设计引物 P-EGFP-I :5' -CCGCTCGAGGATGGTGAGCA AGGGCGAGG-3' 和 P-EGFP-2 :5' -CCCATCGAT TTATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'，并以 pEGFP-C3 质粒上的 EGFP基因为模板进行PCR，通过PCR反应获得两端携带有XhoI和ClaI两个限制性内切酶 的酶切位点的EGFP基因，片段为745bp ; 步骤二：以pSCll质粒为出发质粒。分析pSCll质粒后发现在不影响其他原件的 功能的情况下，有两个酶切位点XhoI和ClaI正好处于LacZ基因的两侧。将pSCll质粒与 PCR产物同时进行XhoI和ClaI双酶切；酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接；将连接后的 产物转化到感受态细胞DH5 α ;并进行PCR鉴定、酶切鉴定与基因序列的测定； 步骤三：在Pll与P7. 5两个启动子之间插入限制性内切酶位点。 Pll与P7. 5是痘苗病毒的两个高效启动子，在pSCll质粒中这两个启动子位置相 邻方向相反，分别启动标记基因 LacZ和MCS中连接的外源基因的表达。在两个启动子之间 插入限制性内切酶的酶切位点，用于插入TKL的同源序列以进行分子内同源重组而删除标 记基因。本研宄中插入的DNA序列为：CTTAAGTGTACAACTAGTGCTAGC下划线为：Af III与NheI 两个酶切位点。 步骤四：在Pll与P7.5两个启动子之间插入TKL的同源序列TKL'本文档来自技高网...
【技术保护点】
构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体，该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能插入外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动插入的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，其特征在于，其还携带有两端带有同源序列的自删除标记基因系统。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾毅，李莉莉，周玉柏，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。