一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用。本发明专利技术所提供的表达载体包含表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次包括如下元件：启动子甲、选择标记基因和终止序列甲；所述表达盒乙依次包括如下元件：启动子乙、内含子和终止序列乙；所述表达盒乙中，所述启动子和所述内含子之间具有多克隆位点甲；所述内含子和所述终止序列之间具有多克隆位点乙；所述多克隆位点甲和所述多克隆位点乙中均具有一个以上酶切识别序列；所述表达载体中其它位置的酶切识别序列与所述多克隆位点甲中的酶切识别序列和所述多克隆位点乙中的酶切识别序列均不相同。实验证明，利用本发明专利技术提供的表达载体可制备无选择标记的转基因植株，在获得安全型转基因植物方面具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用。
技术介绍
20世纪以来，基因工程育种一直被认为是改良植物产量、品质和抗逆性的有效途径。事实上，利用基因工程育种技术已经培育了一些转基因植物新品种，如转基因大豆、棉花、玉米和油菜等，并在生产实践中得到了大面积应用。尤其近5年来，植物转基因研究的发展非常迅速，利用转基因方法培育的植物品种逐年增加。同时，由于很多国家政府和消费者对转基因植物安全性的重视，以及转基因植物内在的安全性障碍，多数转基因植物品种难以获准商业化生产。其中，筛选标记基因的存在是转基因植物安全性的最大隐患之一。选择标记基因的广泛应用虽然提高了获得转基因植物的效率，但由于选择标记基因大多属于编码抗生素或除草剂的抗性基因，随着选择过程的结束，这些外源选择基因在植物基因组中的存在和表达变的多余，且它们会随着转基因植物的繁育而遗传给子代，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。转基因植物安全问题主要体现在食品安全和环境安全两个层面。在食品安全方面，抗生素类基因及其产物对人类或者畜牧可能具有潜在毒性及致敏性，一旦食物中有所残留，它们将有可能传入微生物中，进而可能增加人或动物消化道内的微生物数量，危及人及牲畜的健康。在环境安全方面，选择标记基因有可能会通过基因漂移传播到野生近缘种中，使杂草获得相应抗性，导致超级杂草的出现，此外，选择标记基因传播到其他生物体中，可能会破坏生态系统的平衡。选择标记基因及其它冗余基因的剔除，可降低转基因植物的潜在风险，利于转基因植物安全评价和推广。故此，培育安全型转基因植物是目前的研究热点之一。获得转基因植物涉及到的筛选标记有两类，一类是细菌筛选标记，如amp、kan、aadA等，用于筛选构建的载体及转化的细菌；另一类是植物筛选标记，如nptII、bar、hpt等，用于筛选转化的植物细胞和再生植株。基因枪介导法不但转入了植物筛选标记，也转入了细菌筛选标记。农杆菌介导法虽然可以避免将细菌筛选标记引入植物，但位于同一T-DNA区域的目标基因与筛选标记转入植物后紧密连锁。因此，人们先后提出了几种获得无筛选标记转基因植物的技术，包括共转化法、定位重组体系、多元自动转化载体系统、转座子系统和同源重组体系等，但只有共转化法应用最为成功。基因枪介导的共转化法虽然可以去除植物筛选标记，但不能去除细菌筛选标记。农杆菌介导的共转化法不但可以避免将细菌筛选标记转入植物，而且可以避免将nptII、bar、hpt等筛选标记转入植物，在获得安全型转基因植物方面具有独特优势。在利用农杆菌介导的共转化法获得安全型转基因植物方面，构建含目标基因的双T-DNA载体是一项非常烦琐的工作。虽然有报道通过构建双T-DNA载体获得了无筛选标记基因的转基因烟草、大豆等，但这些双T-DNA载体由于缺少调控序列和多克隆位点，并不通用，每转化一个基因都需要经过几个中间载体从头开始构建双T-DNA载体，费时费力，而且又难以成功。所以，开发一个既含双T-DNA区段和多克隆位点又含调控序列和适宜筛选标记的双元表达载体，能够方便、快捷插入目标基因全长cDNA或gDNA，对于获得安全型转基因植物具有重要意义。此外，一般利用转基因对基因的功能进行验证时，主要采取过表达该基因和沉默该基因两种途径，因此构建一个既能进行过表达又能沉默(RNA干扰)的无筛选标记的安全型转基因载体也尤其重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何获得安全型的转基因植物。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种表达载体。本专利技术所提供的表达载体，包含表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次包括如下元件：启动子甲、选择标记基因和终止序列甲；所述表达盒乙依次包括如下元件：启动子乙、内含子和终止序列乙；所述表达盒乙中，所述启动子乙和所述内含子之间具有多克隆位点甲；所述内含子和所述终止序列之间具有多克隆位点乙；所述多克隆位点甲和所述多克隆位点乙中均具有一个以上酶切识别序列；所述表达载体中其它位置的酶切识别序列与所述多克隆位点甲中的酶切识别序列和所述多克隆位点乙中的酶切识别序列均不相同。所述启动子甲可为35S启动子或UBI启动子。所述启动子乙可为35S启动子或UBI启动子。所述终止序列甲可为NOS终止子或ployA。所述终止序列乙可为NOS终止子或ployA。所述35S启动子的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第2213至3039位的反向互补序列。所述UBI启动子的核苷酸序列可为序列表序列1的自5’末端起第10950至12942位的反向互补序列。所述NOS终止子的核苷酸序列可为序列表序列1的自5’末端起第10121至10395位的反向互补序列。所述ployA的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第1479至1647位的反向互补序列。所述选择标记基因可为bar基因。所述bar基因的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第1648至2212位的反向互补序列。所述多克隆位点甲中可具有如下酶切识别序列：PstⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、KpnⅠ、SalⅠ、NheⅠ和XholⅠ。所述多克隆位点乙中可具有如下酶切识别序列：SpeⅠ和SacⅠ。所述多克隆位点甲的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第10894至10949位的反向互补序列。所述多克隆位点乙的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第10396至10404位的反向互补序列。所述表达载体自5'末端至3'末端依次可包括所述表达盒甲和所述表达盒乙。所述表达载体的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示。上述任一所述表达载体在制备转基因植物中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述表达载体在制备转基因植物中的应用具体可为通过上述任一所述的表达载体将目的基因导入受体植物，得到转基因植物；该转基因植物与受体植物相比，所述目的基因的表达升高。在本专利技术的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因。上述任一所述表达载体在制备转基因植物中的应用具体可为通过上述任一所述表达载体使受体植物中的目的基因功能丧失，得到转基因植物；该转基因植物与受体植物相比，所述目的基因的表达降低；所述“使受体植物中的目的基因功能丧失”是通过RNA干扰实现的。为解决上述问题，本专利技术还提供了制备转基因植物的方法。本专利技术所提供的制备转基因植物的方法具体可为方法一，包括如下步骤：将目的基因插入上述任一所述的表达载体中的所述表达盒乙中的酶切识别序列，然后转化受体植物，借助选择标记基因进行筛选，得到T0代植株；将所述T0代植株进行自交，得到含有所述目的基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株，即无选择标记的转基因植株。本专利技术所提供的制备转基因植物的方法具体可为方法二，包括如下步骤：以上述任一所述的表达载体为出发载体，在多克隆位点甲中插入目的基因中的特定区段，在多克隆位点乙中插入所述目的基因中的特定区段的反向互本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，包含表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次包括如下元件：启动子甲、选择标记基因和终止序列甲；所述表达盒乙依次包括如下元件：启动子乙、内含子和终止序列乙；所述表达盒乙中，所述启动子乙和所述内含子之间具有多克隆位点甲；所述内含子和所述终止序列之间具有多克隆位点乙；所述多克隆位点甲和所述多克隆位点乙中均具有一个以上酶切识别序列；所述表达载体中其它位置的酶切识别序列与所述多克隆位点甲中的酶切识别序列和所述多克隆位点乙中的酶切识别序列均不相同。

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，包含表达盒甲和表达盒乙；
所述表达盒甲依次包括如下元件：启动子甲、选择标记基因和终止序列甲；
所述表达盒乙依次包括如下元件：启动子乙、内含子和终止序列乙；
所述表达盒乙中，所述启动子乙和所述内含子之间具有多克隆位点甲；所述内含子和所述终止序列之间具有多克隆位点乙；
所述多克隆位点甲和所述多克隆位点乙中均具有一个以上酶切识别序列；
所述表达载体中其它位置的酶切识别序列与所述多克隆位点甲中的酶切识别序列和所述多克隆位点乙中的酶切识别序列均不相同；
所述表达载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。


2.权利要求1所述的表达载体在制备转基因植物中的应用。


3.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将目的基因插入权利要求1所述的表达载体中的所述表达盒乙中的酶切识别序列，然后转化受体植物，借助选择标记基因进行筛选，得到T0代植株；将所述T0代植株进行自交，得到含有所述目的基因且不...

【专利技术属性】
技术研发人员：王轲，刘会云，叶兴国，王坤扬，伍小波，杜丽璞，李婕琳，李欣，李仕金，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11