包含苹果根系发育相关基因MdMIEL1的遗传构建体及其应用。本发明专利技术涉及一种遗传构建体，其包含处于强启动子控制下的编码嘎啦苹果的E3泛素连接酶的DNA序列SEQ ID NO:1。本发明专利技术还涉及该遗传构建体用于产生转基因拟南芥的用途。本发明专利技术还涉及一种用于产生侧根增多的拟南芥株系的方法，其特征在于，包括将本发明专利技术的遗传构建体导入拟南芥中，得到转基因拟南芥种子，然后通过对所述转基因拟南芥种子的子代进行多轮筛选来得到纯合拟南芥株系。通过本发明专利技术得到了侧根增多的转基因拟南芥株系。
【技术实现步骤摘要】
包含苹果根系发育相关基因MdMIEL1的遗传构建体及其应用
本专利技术涉及植物遗传工程领域，更特别地，涉及使用遗传工程技术得到侧根数量更多的拟南芥的方法。
技术介绍
植物根系在水分吸收、养分吸收、固定植物、合成植物生长物质以及与根际周围的微生物相互作用等方面发挥着重要的作用。植物的根从发生部位上可分为主根和侧根。测根的发生首先从主根的中柱鞘细胞启动，其后该细胞通过分离、分化形成侧根原基，然后继续发育并突破表皮形成侧根。拟南芥的侧根发育过程中，受到一系列因子的调控。生长素运输基因表达产物AuxI将生长素转运至中柱鞘细胞，PIN家族成员输出生长素，使得中柱鞘细胞中形成生长素浓度梯度。当生长素浓度高时，其诱导细胞中的抑制物AUX/IAA通过泛素/蛋白酶体途径降解，从而激活与侧根发生和发育相关的基因通路。E3泛素连接酶是参与泛素/蛋白酶体途径的分子，其能识别靶位点并将泛素分子连接到靶位点，在蛋白质的泛素/蛋白酶体降解过程中起重要作用。因此，E3泛素连接酶有可能参与到了拟南芥侧根发生和发育的过程中。
技术实现思路
本专利技术的目的是得到侧根增多的拟南芥转基因株系。专利技术人以SEQIDNO:2和3所示的正向和反向引物，以嘎啦苹果为模板，通过PCR的方式扩增得到了嘎啦苹果中的E3泛素连接酶基因MdMIEL1，然后通过分子生物学技术和遗传工程的手段实现了本专利技术的目的。本专利技术提供了一种遗传构建体，包含处于强启动子控制下的嘎啦苹果的E3泛素连接酶基因(MdMIEL1)片段，所述基因片段具有SEQIDNO:1所示的序列。进一步地，所述强启动子是能在拟南芥中组成型表达的强启动子。例如病毒来源的启动子，如CaMV35S、CsVMV启动子、BSV启动子、MMV启动子等；植物来源的启动子，例如actin2基因启动子、Ubi.U4基因启动子等。进一步地，所述遗传构建体还包含一个或多个产生抗抗生素的抗性基因，例如抗潮霉素基因。通过包含这样的基因，可有利于对带有该遗传构建体的转基因拟南芥细胞和所述用于筛选转化的细菌进行筛选。进一步地，所述遗传构建体包含所述MdMIEL1基因片段的pCAMBIA1300质粒，其中所述MdMIEL1基因片段处于所述pCAMBIA1300质粒上的CaMV35S启动子的控制下。本专利技术还涉及一种用于产生侧根增多的拟南芥株系的方法，包括将权利要求1所述的遗传构建体导入到拟南芥中，得到转基因拟南芥种子，然后通过对所述转基因拟南芥种子的子代进行多轮筛选来得到纯合拟南芥株系。。进一步地，所述方法包括以下步骤：1)用本专利技术所述的遗传构建体转化农杆菌感受态细胞，并筛选得到单克隆转化子；2)培养步骤1)中得到的单克隆转化子，收集菌体，并制成侵染液；3)用步骤2)中得到的侵染液侵染拟南芥花序，通过侵染得到转基因的拟南芥；4)收集所述花序产生的拟南芥种子，进行多代的抗生素(潮霉素)和PCR筛选，以得到纯合的转基因拟南芥株系。所述筛选方法是本领域已知的，例如首先将侵染花序产生的种子在含50mg/l潮霉素的培养基中培养，对能在其中生长的拟南芥植株进行PCR，以确认其基因组中存在所转基因。然后，收集所述植株产生的种子，进行下一轮筛选，以后的筛选过程中潮霉素浓度为100mg/l。这种筛选可进行三轮至多轮，直至确保得到纯合的转基因拟南芥株系为止。附图说明图1为本专利技术的遗传构建体的质粒图；图2示出了通过本专利技术的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南芥(col)中MdMIEL1的表达水平；图3为本专利技术通过本专利技术的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南芥(col)萌发后的植株及根系的照片；图4示出了通过本专利技术的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南芥(col)的主根长度；图5示出了通过本专利技术的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南芥(col)的侧根数量。具体实施方式专利技术人在对嘎啦苹果的研究过程中发现其E3泛素连接酶基因(MdMIEL1)在嘎啦苹果处于逆境过程中上调表达，暗示其可能在嘎啦苹果的抗逆境过程中起着一定作用。将该基因克隆出来，在模式生物拟南芥中进行研究时，出乎意料地，发现该基因在拟南芥中的过表达能够增加拟南芥的侧根数量。专利技术人根据这个特性，完成了本专利技术。以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例实施例1嘎啦苹果MdMIEL1基因的克隆1.嘎啦苹果组培叶片RNA提取通过CTAB法提取嘎啦苹果组培叶片的总RNA，包括以下步骤：1)取1.5g经200mMNaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；2)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液(CTAB20％w/v，Tris-HCl0.1mol/l，EDTA25mol/l，NaCl2mol/l，巯基乙醇2％w/v，PVP2％w/v，无RNA酶的双蒸水定容，其中PVP和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5小时；3)加入与上步离心管液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡0.5小时，4℃、12,000rpm离心20分钟；将上清液转移到新的50ml离心管中；4)加入1/3上清液体积的10mol/L预冷LiCl，-20℃放置3小时，12,000rpm离心30分钟，弃上清液；5)加入500μlSSTE缓冲液(NaCl1mol/l，SDS0.5％w/v，EDTA10mol/l，无RNA酶的双蒸水定容)充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中；6)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5ml离心管；7)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5ml离心管；8)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2小时；9)于4℃、12,000rpm离心20分钟，70％乙醇洗2次；10)于4℃、14,000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；加入20μlDEPC水溶解RNA。11)置-80℃储藏备用，或立即进行以下反转录实验。2.将总RNA反转录得到cDNA总RNA的反转录使用市售的反转录试剂盒，并根据制造商的说明书来进行。3.MdMIEL1全长DNA序列的扩增用引物对MdMIEL1-F/MdMIEL1-R，以上述反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。MdMIEL1-F：5’-ATGGAAGGCTCAGCCAATGAAC-3’(SEQIDNO:3)；MdMIEL1-R：5’-TTGAGGAAGAACTGGAGGGGC-3’(SEQIDNO:4)。扩增体系：纯化的cDNA产物25μl，5×TdT缓冲液10μl，0.1％BSA5μl，10mMdCTP2.5μl，TdT15U，双蒸水定容至50μl。扩增程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸60秒，进行32个循环；72℃充分延伸10分钟。PCR反应结束后，回收PCR产物并将其连接到pMD-18本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种遗传构建体，其特征在于，包含处于强启动子控制下的编码嘎啦苹果的E3泛素连接酶基因片段，所述基因片段具有SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种遗传构建体，其特征在于，包含处于强启动子控制下的编码嘎啦苹果的E3泛素连接酶基因片段，所述基因片段具有SEQIDNO:1所示的DNA序列，所述E3泛素连接酶可使拟南芥株系的侧根增多。2.根据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于，所述强启动子是能在拟南芥中组成型表达的强启动子。3.根据权利要求2所述的遗传构建体，其特征在于，所述强启动子是CaMV35S启动子。4.根据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于，还包含一个或多个产生抗抗生素的抗性基因。5.根据权利要求4所述的遗传构建体，其特征在于，所述一个或多个抗性基因包括抗潮霉素基因。6.根据权利要求1所述的遗传构建体，其特征在于，所述构建体为包含所述编码嘎啦苹果的E3泛素连接酶的DNA序列的pCAMBIA1300质粒，其中所述编码嘎啦苹果的E3泛素连接酶的DNA序列处于所述pCAMB...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝玉金，安建平，王小非，由春香，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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