玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为IDF: TATTCCCGAACGGGTCCC，IDR: CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；其内参引物序列为CF: GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，CR: CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。本发明专利技术玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率，并可直接应用于实践，为通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系或杂交种提供技术支撑。

Functional molecular markers and application of maize germinating potential gene ZmGLP

The present invention discloses a kind of functional molecular markers in Maize Germination potential of ZmGLP gene, the primers of PCR sequence IDF: TATTCCCGAACGGGTCCC IDR: CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA,; the internal control primers sequence CF: GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT, CR: CGTTGAAGGCACGGGTAAGC. Functional molecular marker of the invention of Maize Germination potential of ZmGLP gene does not depend on the molecular genetic mapping, the functional markers can greatly improve the efficiency of marker assisted selection, and can be used directly in practice, as the method of breeding by molecular marker assisted selection of high germination rate inbred lines or hybrids provide technical support.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其在育种中的应用。
技术介绍
在玉米生产投入中，种子是最基本、最有效的投入，也是最特殊的生产资料，直接影响着生产者、经营者和使用者的经济利益。在诸多衡量种子质量的指标中，发芽率是最直接有效的评价标准，对于种子收购、储藏、调运等有重要意义，同时也是田间确定播种量的依据。在我国的农业生产中几乎每年都有因种子发芽率低而导致玉米减产的案例，近些年来，一些大型跨国种子企业如先锋、先正达等先后进入中国市场，除具有品牌优势外，其生产的玉米杂交种子同时还具有发芽率高、能够实现单粒播种的质量优势，这是其迅速占据国内市场的一个主要原因。因此，如何提高种子发芽率、培育适宜单粒点播的玉米新品种是增强我国玉米种业参与国际和国内竞争所亟待解决的问题，对保证我国粮食安全具有重要意义。尽管种子发芽率是环境和遗传因素共同作用的结果，但其本身的遗传特性是造成不同品种间发芽率差异的主要原因。种子萌发能力的强弱是决定发芽率的关键因素，因此，阐明玉米种子萌发相关基因与发芽率之间的关系、发掘影响玉米萌发特性的优良等位基因，是选育高发芽率玉米新品种、确保种子质量的有效途径。大量的育种和生产实践证明不同玉米自交系的发芽率存在广泛的遗传变异，因此，可以利用现有种质资源发掘玉米发芽率相关的优良等位基因，进而通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系和杂交种，对提高我国玉米种子质量具有重要意义。种子萌发特性是决定种子发芽率的一个最基本指标，许多学者对种子萌发相关基因进行了大量研究，但这些研究主要集中在麦类和拟南芥等植物中。如Dunwell等在小麦萌发早期的胚中发现了一种对热异常稳定的萌发素蛋白，该蛋白包含cupin蛋白的保守结构域，同时与萌发素蛋白相似的类萌发素蛋白也具有cupin蛋白的保守结构域。而cupin蛋白广泛存在于生物体中，它由一类结构相似、功能各异的蛋白组成超蛋白家族，cupin超蛋白家族具有保守的桶状折叠特征。在小麦、大麦和水稻的萌发过程中，萌发素蛋白具有草酸氧化酶活性，能够催化依赖锰离子的氧化脱羧反应，在植物的抗病性反应中起作用；在苔藓和高等植物中，天然萌发素和特定类型的类萌发素具有超氧化物歧化酶的活性，能够清除生长发育过程产生的活性氧自由基，在植物的抗胁迫反应中有重要作用；在拟南芥种子萌发过程中，信号转导相关G蛋白α亚基的互作因子是具cupin结构域的AtPirin1蛋白；Lapik等利用插入突变和体外实验证实了cupin蛋白对拟南芥种子萌发和幼苗发育的调控作用。可见，具有cupin结构域的基因在多种植物的种子萌发过程中起到重要作用。玉米种子发芽率是一个复杂的数量性状，在自然群体中存在广泛的遗传变异，且玉米基因组的核苷酸多态性非常丰富，为利用关联分析方法解析种子发芽率相关性状奠定了基础。与连锁分析相比，关联分析不但能大大缩短研究年限，而且能同时检测同一基因座位的多个等位基因，作图精度可以达到单基因水平，更有可能检测到引起表型变异的真正核苷酸位点。因此，利用候选基因关联分析方法挖掘基因内对目标性状有正向贡献的等位基因，在植物的多个重要农艺性状的研究中得到了广泛应用，并在实际生产中得到了验证，如玉米类胡萝卜素合成途径关键酶编码基因的关联分析和功能标记应用（Hajesetal,2008；Yanetal.2008；Fuetal.2010），已展现了候选基因关联分析方法研究数量性状的美好前景。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术根据种子萌发过程中鉴定的差异表达蛋白质，克隆了该蛋白质的编码基因，通过候选基因关联分析发掘基因内的有利等位变异，并开发出了相应的功能分子标记，为通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系和杂交种提供技术支撑。为解决上述问题，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术以我国农业生产上大面积使用的农大108、郑单958、先玉335、豫玉22、浚单20和浚单18等玉米杂交种及其相应的亲本为基础材料，利用蛋白质双向电泳技术研究了不同杂交种及其相应亲本种子萌发过程中的蛋白质组学差异，在多个杂交种及其对应亲本萌发过程中均发现一个差异表达的蛋白，质谱分析结果表明该蛋白具有cupin蛋白的保守结构域。在此基础上，克隆该候选基因，并命名为ZmGLP，其核苷酸序列如序列1所示。通过候选基因关联分析方法证明该基因与玉米种子发芽势显著关联，并开发了PCR功能分子标记，对ZmGLP基因在生产中的应用提供了技术支撑。利用该功能分子标记辅助选择结合常规育种实现有利等位基因的定向转移，提高现有自交系的发芽率并创制高发芽率的新种质，组配出发芽率高的玉米新品种，有助于解决部分玉米杂交种及自交系种子发芽率低的问题。上述玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记的PCR引物序列如下：IDF:TATTCCCGAACGGGTCCC，IDR:CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；其内参引物的核苷酸序列为：CF:GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，CR:CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。上述玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记检测方法，包括以下步骤：（1）配制15μL反应体系，包括：DNA模板10ng/μL3.0μLdNTP2.5mmol/L1.2μL10×PCRBuffer1.5μLIDF10μmol/L0.3μLIDR10μmol/L0.3μLCF10μmol/L0.3μLCR10μmol/L0.3μLTaqDNApolymerase2.5U/μL0.3μLddH2O7.8μL；（2）进行PCR扩增程序：TD65～56℃；1个循环95℃3.0min；10个循环95℃1.0min、65℃退火1.0min、72℃延伸1.5min；25个循环95℃变性1.0min、56℃退火1.0min、72℃延伸1.5min；Delay72℃10.0min；Soak4℃；其它步骤同常规方法。本专利技术具有以下积极有益的技术效果：（1）本专利技术得到的是基于功能基因内开发的引起表型变异的功能标记，是建立在关联群体中等位基因的功能性基序中单核苷酸多态性位点基础上的一类新型显性分子标记，它不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率。（2）玉米自然群体中不同自交系的发芽率及萌发特性具有广泛的遗传变异，因此本专利技术通过候选基因关联分析发掘的ZmGLP基因内影响种子萌发特性的优异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为IDF: TATTCCCGAACGGGTCCC，IDR: CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；其内参引物序列为：CF: GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，CR: CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。

【技术特征摘要】
1.一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为
IDF:TATTCCCGAACGGGTCCC，
IDR:CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；
其内参引物序列为：
CF:GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，
CR:CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。
2.权利要求1所述功能分子标记在玉米育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：
（1）配制15μL反应体系，包括：
DNA模板10ng/μL3.0μL
dNTP2.5mmol/L1.2μL
10×PCRBuffer1.5μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：付志远，汤继华，丁冬，李卫华，李浩川，薛亚东，郭占勇，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41