本发明专利技术是利用Bac-to-Bac系统对基因组不含有gp64的杆状病毒进行基因工程遗传改良的方法，其包括重组病毒的构建，重组病毒多角体的扩增和重组病毒的生物测定；构建策略为在棉铃虫核多角体病毒HearNPVbacmid的多角体蛋白基因位点，插入由苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒基因启动子及冷杉毒蛾核多角体病毒的囊膜糖蛋白基因启动子共同控制的gp64基因，以及在AcMNPV多角体蛋白基因启动子和HearNPV多角体蛋白基因启动子共同控制下的HearNPV多角体蛋白基因，构建了一株共表达GP64和F蛋白两种囊膜糖蛋白的重组棉铃虫核多角体病毒。本发明专利技术比野生型病毒具有更好的杀虫活性，且有很高的生物安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物杀虫剂的遗传改良领域，具体涉及一种在杆状病毒组II核多角体病毒(group II NPV)中表达组I核多角体病毒(group I NPV)的囊膜糖蛋白基因的构建方法。该表达组I核多角体病毒(group I NPV)毒株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，100101)。保藏日期是2011年6月24日，保藏号为CGMCC No :4976。
技术介绍
杆状病毒的天然宿主大部分是农林业的害虫。1973年，杆状病毒被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐为化学农药的理想替代品。目前，我国已有6种杆状病毒杀虫剂正式登记注册。杆状病毒对宿主昆虫具有专一而强烈的致病性，能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物安全无害，不污染环境，是理想的“生物农药”。然而，杆状病毒杀虫速度较慢、杀虫谱窄，严重阻碍其大规模应用。在杆状病毒出牙型病毒粒子(BV)囊膜的表面，存在许多由糖蛋白组成的刺突状结构，它们在介导病毒与受体结合，膜融合及出芽等过程发挥关键作用。group I NPV BV的主要囊膜糖蛋白为GP64，group II NPV BV的主要囊膜糖蛋白是F蛋白。GP64和F蛋白均是低PH诱导的膜融合蛋白。研究表明，GP64比F蛋白具有更强大的膜融合能力，而含有GP64的group I代表株AcMNPV与含F蛋白的group 11代表株HearNPV相比，具有更广的宿主域和更高的杀虫活性。上述杆状病毒组II核多角体病毒(group II NPV)中表达组I核多角体病毒(group I NPV)囊膜糖蛋白甜似基因的序列表在文章末尾。该序列表摘自NCBI数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/1403961, Gene ID 为1403961)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种表达甜似基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，该方法操作简单，所构建的重组病毒具有生物安全性，其在农业的害虫防治方面具有广泛的应用前景。本专利技术解决其技术问题采用以下的技术方案本专利技术提供的表达甜似基因的新型基因工程重组病毒是在组II核多角体病毒的基因组中表达AcMNPV GP64，其中AcMNPV是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒Auto耵aphacalifornica multiplenucleopolyhedrovirus 的英文缩写，GP64 是 AcMNPV 的囊膜糖蛋白。本专利技术通过对野生型棉铃虫核多角体病毒Wico^rpa armigera singlenucleopolyhedrovirus,简称为HearNPV进行基因工程遗传改良后得到。具体改良方法是在HearNPV bacmid HaBacHz8的多角体蛋白基因、polh )位点，插入由AcMNPV基因启动子pPIO及冷杉毒蛾核多角体病毒Orgyia pseudotsugata multiplenucleopolyhedrovirus,简称为OpMNPV的囊膜糖蛋白基因启动子p0pl66共同启动的AcMNPV的gp64基因，以及由AcMNPV多角体蛋白基因启动子pAcPoIh和HearNPV多角体蛋白基因启动子pHaPolh共同启动的HearNPV多角体蛋白基因，由此得到重组病毒。重组病毒所表达的外源基因为AcMNPV的囊膜糖蛋白基因甜似以及与AcMNPVGP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的衍生基因。本专利技术提供的上述AcMNPV GP64，其在改良基因组不含有^764的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。本专利技术提供的表达甜似基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，其包括以下步骤(1)重组bacmid^a&ac-gp64~polh的构建将含有由AcMNPV 基因启动子pPIO及OpMNPV Op 166基因启动子p0pl66共同控制的AcMNPV gp64基因，以及由AcMNPV polh基因启动子PAcPolh和HearNPV卯炀基因启动子pHaPolh共同控制的HearNPV 炀基因的供体质粒pFB-0p 166-^764-/70从，通过电转化至大肠杆菌DHlOB感受态细胞(该DH10B感受态细胞中含有野生型棉铃虫核多角体病毒HearNPV bacmid HaBacHz8以及编码转座酶的helper质粒的)中，然后通过转座的方法获得重组bacmid ^s&^-gp64-polh ；(2)转染-感染实验将脑ac-gp64-polhDNA 以及 Lipofectin (Invitrogen 公司)分别用无血清Grace培养基稀释，充分混勻后转染5 X IO5个HzAMl细胞；转染6天后收集培养物上清，用其感染一批健康的HzAMl细胞以扩增BV，感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4 ° C避光保存，感染的细胞样品存放于-20 ° C保存；(3)病毒多角体的扩增将重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄幼虫的血淋巴中，置于观C培养，直至虫体液化，收集虫尸；用Vortex将液化的虫尸震碎，通过差速离心的方法获取较纯的多角体，对多角体进行计数后保存于4 C备用；经过上述步骤，得到表达gp64基因的新型基因工程重组病毒^\aRac-gP64-Polh。该病毒的分类命名为棉铃虫核多角体病%Qklicoverpa armigera singlenuclearpolyhedrosis virus)。在步骤(2)中，是通过将5 μ g 脑ac-gp64-polh DNA 以及 12 μ 1 Lipofectinanvitrogen公司)分别用无血清Grace培养基稀释至100 μ 1，充分混勻后转染5 X IO5个HzAMl细胞。在步骤(3)中，是将10 μ 1的重组病毒的BV注射至棉铃虫四龄幼虫的血淋巴中，置于观 C培养，直至虫体液化，收集虫尸。所表达的外源基因为AcMNPV gp64以及与AcMNPV GP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的甜似衍生基因。本专利技术提供的上述构建方法所制备的重组病毒，其在改良基因组不含有的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。本专利技术和现有技术相比具有以下主要的优点其一.不需要对病毒基因组进行复杂的基因操作。本方法采用Bac-to-Bac重组系统，与传统的同源重组手段相比，可以快速简便的插入外源活性基因。其二.杀虫活性提高。经生物测定显示，重组病毒的杀虫活性明显提高。重组病毒的LC5tl平均值为1. 6 X IO4 PIBs/ml，仅为野生型病毒的20%当用3 X IO6 PIBs/ml感染时，重组病毒的ST5tl为90小时，比对照病毒缩短8个小时广8%);而用更低浓度3 X IO5 PIBs/ml感染时，重组病毒的ST50为98小时，比对照病毒缩短16个小时广14%)。其三.生物安全性高。构建重组病毒过程中，采用的是杆状病毒内源性杀虫活性基因AcMNPV甜似基因，避免外源毒素基因的引入，故具有生物安全性。附图说明 图1是重组病毒N\ia&ac-gp64-polh的结构示意图。图2是重组病毒嚇aC-gP64-Polh的转染实验图。白色箭头表示核内有多角体聚集的HzAMl细胞。图3是本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王华林，王曼丽，干盈盈，邓菲，胡志红，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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