本发明专利技术公开了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，所述的Ppmar1转座酶C296I突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。是将野生型Ppmar1转座酶296位置上的半胱氨酸突变为异亮氨酸。该Ppmar1转座酶C296I突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.67倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。
【技术实现步骤摘要】
一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用。
技术介绍
转座子(transposon)是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自20世纪40年代美国遗传学家McClintock首先在玉米中发现转座子(Ac/Ds)以来，科学家们发现了多种类型的转座子，它们广泛存在于细菌、酵母和高等动植物中。随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离基因的重要手段之一。Mariner-Like转座子(Mariner-LikeElements，MLE)是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophilamauristiana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。MLE转座子由两端反向重复序列(TerminalInvertedRepeats，TIRs)和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中“垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用，解决了现有自然界分离的MLE转座酶催化活性较低或者不具备催化活性的问题。本专利技术提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，所述的Ppmar1转座酶C296I突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因，编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因。本专利技术还提供了一种工程菌株，所述工程菌株携带有上述重组质粒。本专利技术还提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体在构建酵母突变体中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供的一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，具有以下有益效果：本专利技术从毛竹中克隆到的活性转座酶，对其进行人工改造之后获得较高活性的MLE转座酶突变体(Ppmar1转座酶C296I突变体)，Ppmar1转座酶C296I突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.67倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，如Sambrook等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。一、野生型MLE转座酶和去除转座酶的非自主性转座子的获得步骤1.1，采集新鲜的毛竹叶片(Phyllostachyspubescens，采集于浙江农林大学植物园，北纬N30°15′14.67″东经E119°43′33.47″)，利用CTAB法提取毛竹基因组DNA，根据MLE转座子TIR保守序列设计引物Ppmar1-5-3(Ppmar1-5-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，得到MLE转座子扩增产物。PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μlrTaqPolymerase(5U/μl)，1μlPpmar1-5-3(10μmol/L)，2μl10×rTaqBuffer(Mg2+plus)，1.6μldNTPmix(2.5mmol/L)，100ng毛竹基因组DNA，加无菌水补齐20μl。PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。步骤1.2，扩增出序列后，采用TaKaRa公司pMDTM18-TVectorCloningKit试剂盒的方法将步骤1.1的MLE转座子扩增产物连接到pMD18-T载体，测序确认后，命名为Ppmar1转座子，Ppmar1转座子全长序列如SEQIDNO.3所示。步骤1.3，采用QIAGEN公司的RNeasyMiniKit试剂盒提取毛竹叶片RNA，通过Invitrogen公司的SuperScriptTMVILOTMcDNASynthesisKit试剂盒将RNA反转录为cDNA，根据Ppmar1转座酶序列设计一对引物PpTpase1-5和PpTpase1-3(PpTpase1-5和PpTpase1-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，回收得到Ppmar1转座酶扩增产物，即为Ppmar1转座酶核苷酸序列。PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μlrTaqPolymerase(5U/μl)，0.5μlPpTpase1-5(10μmol/L)，0.5μlPpTpase1-3(10μmol/L)，2μl10×rTaqBuffer(Mg2+plus)，1.6μldNTPmix(2.5mmol/L)，10ng毛竹叶片cDNA，加无菌水补齐20μl。PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，55℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。步骤1.4，采用TaKaRa公司pMDTM18-TVectorCloningKit试剂盒的方法将步骤1.3的Ppmar1转座酶核苷酸序列连接到pMD18-T载体克隆，测序确认，Ppmar1转座酶核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。将含有Ppmar1转座子全长序列的pMD18-T载体用BseRI切除Ppmar1中间转座酶的大部分序列。酶切体系为50μl，包括5μl10×buffer，1μlBseRI(1U/μl)，1μg质粒(含有Ppmar1全长序列的pMD18-T载体)，加无菌水补齐50μl，37℃温浴6小时。回收质粒大片段，用T4DNALigase将质粒大片段自连接，得到Ppmar1的非自主性转座子pMD18-T-Ppmar1-Tn(Tn表示非自主性转座子)。其中，自连接的体系为10μl，包括1μl1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，其特征在于，所述的转座酶C296I突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，其特征在于，所述的转座酶C296I突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因，其特征在于，编码所述转座酶C296I突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3...
【专利技术属性】
技术研发人员：周明兵，汤定钦，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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