本发明专利技术公开了一种尼帕病毒M基因的荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，设计合成了一套特异性的引物及Taqman探针和阳性对照，并利用该引物及探针建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的荧光RT-PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出尼帕病毒M基因,可用于来自家猪及相关样本中微量尼帕病毒M基因的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体设及一种巧帕病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂 及其制备与使用方法。
技术介绍
巧帕病毒（Nip址Virus,NiV)是1999年确定的一种严重危害家猪和人 类的新病毒，能够引起人和猪的神经系统和呼吸系统疾病（化ua，K.B.，Bellini,W. J. ,Rota,P.A. ,2000.Nipahvirus:arecentlyemergentdeadlyparamyxovirus. Science288, 1432 - 1435.)。在分类上，巧帕病毒属于副粘病毒亚科亨巧帕病毒属成 员，其基因组为单股负链RNA，全长约18. 2化，含有6个转录单位，依次编码核蛋白（脚、 磯蛋白（P)、基质蛋白（M)、融合蛋白（巧、受体结合蛋白似和大蛋白（L)等6个结构 蛋白征arcourtB,TaminA,KsiazekTG,RollinPE,AndersonLJ,BelliniWJ,Rota PA,MolecularcharacterisationofNipahvirus,anewemergentparamyxovirus. Virology, 2000. 271 :p. 334-339.1。巧帕病毒对骗幅不致病，对猪有一定的致病性，而对人 的致病力很强，人感染巧帕病毒后病死率达40%~70%。流行病学的研究表明，携带巧 帕病毒的狐幅是人和猪的巧帕病的传染源，巧帕病毒在感染猪体内大量繁殖，病毒血症持 续时间较长，并通过呼吸道、尿液、粪便等途径向外界散播病原，而人类通过与病猪及其样 本接触可W感染巧帕病毒（TanKS,TanCT,GohKJ,ElpidemiologicalaspectsofNip址 virusinfection.NeurolJSoutheastAsia, 1999. 4:p. 77-81)。由上述可见，对人的巧帕 病毒病而言，携带巧帕病毒的骗幅和猪及其感染材料均是人类巧帕病毒的重要传染源，对 该些感染材料中巧帕病毒M基因的检测及消除是防控人类巧帕病毒病非常重要的措施。目 前对巧帕病毒检测的实验室方法主要包括病毒分离鉴定、检测病原的巧光抗体试验和检测 病毒核酸的RT-PCR方法（DanielsP,KsiazekT,EatonB,LaboratorydiagnosisofNip址 andHen化avirusinfectionsMicrobesInfect, 2001. 3:p. 289-295.)，而用于检测巧帕 病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与应用，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种巧帕病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂 及其制备方法与途，具体设及一种W巧帕病毒M基因为扩增祀序列而研制的检测试剂，该 检测试剂包括一对引物、一条标记探针和一个阳性对照。 为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是通过W下步骤实现的；一种巧 帕病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性 对照，扩增目标长度为70bp，引物和探针序列为：上游引物；NIPAH-M-F:5' -GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3' 沈Q ID NO. 1下游引物；NIPAH-M-R ;5, -AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3，沈Q ID NO. 2探针；NIPAH-M-P:5' -FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3' -MGB 沈Q ID NO. 3 阳性对照；GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCG AGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC 沈Q ID NO. 4。 上述的巧帕病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂的制备方法，包括w下步骤： (1)选择巧帕病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的祀目标序列，其 核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示，为：[001U GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGC TGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC；[001引 似设计4条引物，W之PCR扩增和制备巧帕病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ IDNO. 5-SEQIDNO. 8 如下；…PAH-M-Fl: 5 >-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGT TCC-3' NIPAH-M-Rl: 5^ -GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCC AGG-3, NIPAH-M-F2:5'-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGA TC-3' NIPAH-M-R2:5^ -GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGC TG-3> (3)根据巧帕病毒M基因阳性对照序列设计多对引物和多条探针，经过大量的对 比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：[001 引 上游引物；NIPAH-M-F:5' -GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3' SEQIDNO. 1下游引物；NIPAH-M-R ;5, -AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3，沈Q ID NO. 2探针；NIPAH-M-P:5' -FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3, -MGB SEQ ID NO. 3 (4)探针的5'端标记的巧光报告基团是FAM，3'端标记的非巧光泽灭基团为MGB; (5)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定最适的反应条件、引物及探针的特 异性和灵敏度。 所述巧）中的最适的反应条件为上、下游引物使用浓度为7.5口111〇1/^以探针的使 用浓度为2. 5pmol/yL，在25化体系中加入1yL引物及探针，引物及探针的特异性使其区 别于猪源其它病毒，灵敏度达到46个拷贝。 上述的巧帕病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。 上述的巧帕病毒M基因的巧光RT-PCR检测试剂在绘制巧帕病毒巧光定量RT-PCR 检测标准曲线的用途。 本专利技术的有益效果是；（1)具有特异、敏感、准确、快速的特点，可用于来自猪及其 相关样本中微量巧帕病毒核酸的检测。（2)本专利技术中的巧帕病毒M基因阳性对照制备方法， 既不设及巧帕病毒及其基因组核酸的使用，也不需要人工合成较长的巧帕病毒M基因RNA 片段，具有简便、安全和经济的优势。【附图说明】 图1为最适引物对与标记探针对巧帕病毒M基因阳性对照的巧光RT-PCR扩增曲 线。 图2为最适引物对与标记探针的巧光RT-PCR特异性扩增曲线。 图3为对4. 6 Xl〇7~4. 6X10 "copies/uL浓度范围内的巧帕病毒M基因阳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尼帕病毒M基因的荧光RT‑PCR检测试剂，其特征在于，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度为70bp，引物和探针序列为：上游引物：NIPHA‑M‑F:5’‑GCTCAACAGATTGACCTGGAAC‑3’ SEQ ID NO.1下游引物：NIPHA‑M‑R：5’‑AACAGAAGGCTGCAACACAGC‑3’ SEQ ID NO.2探针：NIPHA‑M‑P:5’‑FAM‑CTCGGCTGATCTCACA‑3’‑MGB SEQ ID NO.3阳性对照：GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC SEQ ID NO.4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，董志珍，肖妍，赵祥平，王玉玲，赵丹，张俊哲，陈小金，王乃福，陈本龙，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津;12
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