本发明专利技术公开了一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法，其包括以下步骤：鸡胚接种部位的确定、样品的稀释、接种、封孔、鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋、鸡胚红细胞凝集价的测定及EID50的计算。本发明专利技术改变鸡胚的接种部位，使接入尿囊腔的病毒液的量更加精确，降低测定结果的误差，封孔时使用速凝胶水替代传统以腊封孔的方法，封孔速度快又安全，收获冷蛋过程，选择采取不同温度逐渐过渡的方法，避免由于温差大造成鸡胚挣扎将卵黄破裂，从而提高病毒效价测定结果的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法。
技术介绍
现有的鸡胚病毒液病毒效价的测定方法存在以下缺陷：1.鸡胚接种部位，选择在鸡胚及脐带侧与气室交界线上方约3mm处，由于每位画接种部位人员及接种人员不同，每位画蛋人员画蛋时画出的倍位离气室边距离有差虽，接种人员针头接进鸡胚的深浅有差别，易造成接种时病毒液未完全接入鸡胚的尿囊腔中，部分接至气室上，造成测定结果有较大的误差。2.接种后的鸡胚用蜡封孔，蜡是用洒精灯加热的，温度较高，封在鸡胚上时由于温度高会造成鸡胚损伤或死亡，同时封蜡的速度较慢，效率低。3.鸡胚收获及冷蛋，将后孵化到期的鸡胚从温室中拿出直接入置2-8度冷库冷蛋，将鸡胚从37度的环境中突然转至2-8度的环境中，对鸡胚的应激较大，易造成鸡胚不适应而用力挣扎，导致鸡胚的卵黄破裂，由于测凝集价是取鸡胚的尿囊液进行测定，在尿囊液中含有卵黄会影响血凝价的判定，影响病毒效价的测定结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高测定结果准确性的鸡胚病毒液病毒效价的测定方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法，包括以下步骤：1)鸡胚接种部位的确定：选择鸡胚侧，鸡胚脐带周围，避开大血管的部位，画直径2-3mm的圆圈作为接种部位，此部位即为最佳的尿囊腔接种部位；2)样品的稀释：取鸡胚病毒液，用生理盐水逐步稀释，得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液；具体可采用如下方法进行梯度稀释：用5ml玻璃吸管吸取灭菌生理盐水4.5ml加入试管中，共吸取若干支试管，根据样品不同而定所需试管数量，用1ml玻璃吸管吸取鸡胚病毒液0.5ml加入第一支试管，然后将试管放置在混匀器上混匀后，从第一支混匀后的试管中吸取0.5ml液体到第二支试管中，再混匀，依此类推，稀释到最后一支试管，得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液；3)接种：使用1ml的一次性注射器吸取所需稀释度的鸡胚病毒液稀释液，每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚，每胚0.1ml；4)封孔：用速凝胶水将上述接种后的鸡胚的接种部位封住；5)鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋：将接种封孔后的鸡胚置36-37℃的恒温恒湿培养箱中培养，根据鸡胚病毒液不一样，后孵化及照蛋频率不一样，收获在规定时间内存活及死亡的鸡胚，然后将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h，然后再移至15℃的温箱中1h，然后再将活胚移至2-8℃的冷库中冷却4-24h，等待测红细胞凝集价；6)鸡胚红细胞凝集价的测定及EID50的计算：同一稀释度死亡的鸡胚等量收集胚液于同一试管中，活鸡胚单个收集胚液，分别测红细胞凝集价，胚液凝集价≥1:160者判为感染，计算病毒效价EID50。在测定过程中如发现极个别鸡胚液浑浊有卵黄破裂的情况，将收集的尿囊液经高速离心机8000r/min离心10min后再用于血凝价测定。上述测定方法中，根据鸡胚病毒液不一样，后孵化及照蛋频率有所差别，以测定新城疫鸡胚病毒液为例，所述的步骤3)接种的具体操作为：使用1ml的一次性注射器吸取10-7、10-8、10-9三个稀释度的新城疫鸡胚病毒液稀释液，每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚，每胚0.1ml；所述的步骤5)鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋的具体步骤为：将接种封孔后的鸡胚置36-37℃的恒温恒湿培养箱中培养，每24h照蛋1-2次，48h以前死亡的鸡胚弃去不计，在48-120h死亡的鸡胚随时取出，直立蛋盘，置2-8℃冷却120h，将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h，然后再移至15℃的温箱中1h，然后再将活胚移至2-8℃的冷库中冷却4-24h，等待测红细胞凝集价。本专利技术所述红细胞凝集价的测定方法按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中红细胞凝集试验的测定方法。本专利技术所述EID50的计算方法按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中病毒半数致死(感染)量(LD50、EID50、TCID50)的测定方法。本专利技术采用以上技术方案，通过鸡胚接种部位的确定、样品的稀释、接种、封孔、鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋、鸡胚红细胞凝集价的测定及EID50的计算六个步骤来测定鸡胚病毒液病毒效价。本专利技术改变鸡胚的接种部位，使接入尿囊腔的病毒液的量更加精确，降低测定结果的误差。封孔时使用速凝胶水替代传统以腊封孔的方法，封孔速度快又安全。后孵化到期的鸡胚、收获及冷蛋，选择采取不同温度逐渐过渡的方法，避免由于温差大造成鸡胚挣扎将卵黄破裂，从而提高病毒效价测定结果的准确性。如果存在极少数破裂的鸡胚，则将收集的尿囊液经过高速离心后，吸取上清液用于测定红细胞凝集价，这样在测凝集价时易于判定，提高测定结果的准确性。具体实施方式一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法，包括以下步骤：1)鸡胚接种部位的确定：选择鸡胚侧，鸡胚脐带周围，避开大血管的部位，画直径2-3mm的圆圈作为接种部位，此部位即为最佳的尿束腔接种部位；2)样品的稀释：取鸡胚病毒液，用生理盐水逐步稀释，得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液；3)接种：使用1ml的一次性注射器吸取所需稀释度的鸡胚病毒液稀释液，每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚，每胚0.1ml；以测定新城疫鸡胚病毒液为例，使用1ml的一次性注射器吸取10-7、10-8、10-9三个稀释度的新城疫鸡胚病毒液稀释液，每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚，每胚0.1ml；4)封孔：用速凝胶水将上述接种后的鸡胚的接种部位封住；5)鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋：根据鸡胚病毒液不一样，后孵化及照蛋频率不一样，以测定新城疫鸡胚病毒液为例，将接种封孔后的鸡胚置36-37℃的恒温恒湿培养箱中培养，每24h照蛋1-2次，48h以前死亡的鸡胚弃去不计，在48-120h死亡的鸡胚随时取出，直立蛋盘，置2-8℃冷却120h，将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h，然后再移至15℃的温箱中1h，然后再将活胚移至2-8℃的冷库中冷却4-24h，等待测红细胞凝集价。6)鸡胚红细胞凝集价的测定及EID50的计算：同一稀释度死亡的鸡胚等量收集胚液于同一试管中，活鸡胚单个收集胚液，分别测红细胞凝集价，胚液凝集价≥1:160者判为感染，计算病毒效价EID50。在测定过程中如发现极个别鸡胚液浑浊有卵黄破裂的情况，将收集的尿囊液经高速离心机8000r/min离心10min后再用于血凝价测定。实施例1一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法，包括以下步骤：1)鸡胚接种部位的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法，其特征在于：其包括以下步骤：1) 鸡胚接种部位的确定：选择鸡胚侧，鸡胚脐带周围，避开大血管的部位，画直径2‑3mm的圆圈作为接种部位；2) 样品的稀释：取鸡胚病毒液，用生理盐水逐步稀释，得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液；3) 接种：用注射器吸取所需稀释度的鸡胚病毒液稀释液，每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚，每胚0.1ml；4) 封孔：用速凝胶水将上述接种后的鸡胚的接种部位封住；5) 鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋：将接种封孔后的鸡胚置36‑37℃的恒温恒湿培养箱中培养，根据鸡胚病毒液不一样，后孵化及照蛋频率不一样，收获在规定时间内存活及死亡的鸡胚，然后将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h，然后再移至15℃的温箱中1h，然后再将活胚移至2‑8℃的冷库中冷却4‑24h，等待测红细胞凝集价；6）鸡胚红细胞凝集价的测定及EID50的计算：同一稀释度死亡的鸡胚等量收集胚液于同一试管中，活鸡胚单个收集胚液，分别测红细胞凝集价，胚液凝集价≥1:160者判为感染，计算病毒效价EID50。
【技术特征摘要】
1.一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1) 鸡胚接种部位的确定：选择鸡胚侧，鸡胚脐带周围，避开大血管的部位，画直径2-3mm的圆圈作为接种部位；
2) 样品的稀释：取鸡胚病毒液，用生理盐水逐步稀释，得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液；
3) 接种：用注射器吸取所需稀释度的鸡胚病毒液稀释液，每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚，每胚0.1ml；
4) 封孔：用速凝胶水将上述接种后的鸡胚的接种部位封住；
5) 鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋：将接种封孔后的鸡胚置36-37℃的恒温恒湿培养箱中培养，根据鸡胚病毒液不一样，后孵化及照蛋频率不一样，收获在规定时间内存活及死亡的鸡胚，然后将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h，然后再移至15℃的温箱中1h，然后再将活胚移至2-8℃的冷库中冷却4-24h，等待测红细胞凝集价；
6）鸡胚红细胞凝集价的测定及EID...
【专利技术属性】
技术研发人员：江兴华，陆奕滨，
申请(专利权)人：福州大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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