用于治疗剂的效价测定制造技术

本文提供了测定治疗剂的致耐受潜力的方法，所述方法包括测定所述治疗剂增加抗原呈递细胞诸如单核细胞、巨噬细胞、B细胞和树突状细胞表达致耐受性标志物例如PD‑L1的能力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术提供测定治疗剂的致耐受性和/或效价的方法。专利技术背景目前，使用不同的测试方法，诸如针对感染或疾病的物理化学性质、抗原性、免疫原性、感染性测定和预防，测量治疗剂的效价。本申请依赖于治疗剂性质和测试目的。例如，就疫苗而言，效价通常通过测量靶动物物种或另一个物种(如小鼠或大鼠)中的免疫应答来测定。前述报告指出，自体免疫疾病的T细胞免疫疗法，如利用减毒自体反应性T细胞进行疫苗，通过提高对自体反应性T细胞的抗独特型和/或抗工效型活性诱发调节性免疫应答以控制异常自体免疫应答。据认为，自体抗原特异性T细胞的施用可引发独特的旁分泌信号，这促进了抗原呈递细胞(APC)和/或效应子T细胞的致耐受性网络，从而协助控制与自体免疫紊乱相关的炎症。因此，测定此类基于T细胞的治疗剂的效价需要测量调节性免疫应答的诱导。需要能够测量治疗剂(尤其是诱导调节性免疫的治疗剂)的效价的高通量、优选体外测定。专利技术概述本文公开了评估治疗剂的效价的方法，该方法包括测定治疗剂的致耐受性。测定治疗剂的致耐受性的方法通常包括以下步骤：使治疗剂优选体外接触包含测试抗原呈递细胞的试样；测量接触治疗剂的测试抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达；以及将测试抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达与适当的对照比较；其中与对照抗原呈递细胞相比，测试抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达增加确定治疗剂具有致耐受性。在优选的实施方案中，至少一个致耐受性标志物包含PD-1配体，如PD-L1。在优选的实施方案中，测量步骤在接触步骤后约24-72小时内，更优选地在约48-72小时内，最优选地在约72小时内进行。在一个实施方案中，治疗剂的效价与治疗剂的致耐受性直接相关。在一个实施方案中，将治疗剂施用于需要其的患者，使患者对特定的试剂耐受化，如下调患者对该抗原诸如过敏原或自体抗原的免疫应答。在一个实施方案中，治疗剂选自过敏原、其耐受化表位、包含过敏原特异性免疫细胞的疫苗、包含过敏原特异性免疫细胞的片段疫苗以及编码过敏原或其耐受化表位的核酸。优选地，治疗剂选自自体抗原、其耐受化表位、包含自体抗原特异性免疫细胞的疫苗、包含自体抗原特异性免疫细胞的耐受化片段的疫苗以及编码自体抗原或其耐受化表位的核酸。在一个示例性优选的实施方案中，治疗剂包含自体抗原特异性T细胞，其中自体抗原优选地选自髓鞘蛋白(如，髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白)、水通道蛋白4以及血小板糖蛋白IIb-IIIa和Ib-IX。最优选地，治疗剂包含髓鞘蛋白特异性减毒T细胞。在另一个实施方案中，T细胞与测试和对照抗原呈递细胞是异体的。在某些优选的实施方案中，T细胞与测试和对照抗原呈递细胞是自体的。在优选的实施方案中，包含抗原呈递细胞的测试和/或对照样品包括单核细胞、树突状细胞、B细胞和/或衍生自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或B细胞的细胞系。在一些实施方案中，抗原呈递细胞包括衍生自单核细胞(如，U937、THP-1等)的细胞系。优选地，测试和对照抗原呈递细胞包括B细胞。最优选地，测试和对照抗原呈递细胞包括单核细胞。在一个实施方案中，至少一个致耐受性标志物与抗原呈递细胞的至少一个标志物(诸如CD86)一起组合测量。更优选地，使用检测致耐受性标志物以及任选地抗原呈递细胞标志物的高通量方法。最优选地，使用流式细胞分析实时检测抗原呈递细胞上至少一个致耐受性标志物(如，PD-L1)和抗原呈递细胞标志物(优选地CD86)的细胞表面表达。本文还提供了测定治疗剂的致耐受性的试剂盒，该试剂盒包括致耐受性标志物的抗体和抗原呈递细胞标志物的抗体。优选地，该试剂盒还可包括检测一个或多个抗体的检测试剂和/或使用该试剂盒的说明。附图说明图1示出了流式细胞点图，该图示出了在(A)单独或(B)存在的情况下孵育时，自体淋巴细胞(CD86-，x-轴)或自体单核细胞(CD86，x-轴)的细胞表面PD-L1表达(y-轴)。图2示出了在单独(■)或存在自体T细胞的情况下(□)孵育时，五个独立的产品(x-轴)的细胞表面表达PD-L1的单核细胞的百分比(y-轴)。图3示出了在与自体T细胞一起孵育后，五个独立的产品(x-轴)的结合荧光抗PD-L1抗体的单核细胞的平均荧光强度(MFI，y-轴)倍数变化。图4示出了在单独或与T细胞一起孵育(A)24小时或(B)72小时后，异体产品的细胞表面表达PD-L1的免疫细胞的百分比(y-轴)。具体实施方式据信，抗原呈递细胞(APC)尤其是专职性抗原呈递细胞，在辐照相互作用时，凋亡细胞(诸如减毒自体反应性T细胞)能够经历显著的表型和致耐受性变化。在辐照暴露后，自体白细胞、树突状细胞显示出致耐受特性，包括IL-10的分泌增加以及未暴露的T细胞增殖的刺激修复(Zheng DH等(2010)Biochem Biophys Res Commun.395(4):540-6)。此外，HIV慢性病毒感染导致各种细胞类型上PD-L1的表达增加，单核细胞分泌IL-10以及T细胞扩增抑制(Said EA等(2010)Nat Med.16(4):452-9)。T细胞扩增和功能通过例如PD-L1和PD-1之间以及IL-10R和IL-10之间的相互作用的阻断恢复，暗示涉及PD-L1和/或IL-10、它们在各自途径中各自的受体和其它分子的相互作用可作为耐受性诱导的有效标志物。如本文所用，致耐受性标志物可包括这样的蛋白质：其上调表达可立即通过接触耐受化剂的抗原表达细胞检测。例如，包含PD-1配体(优选地PD-L1)的致耐受性标志物的表达可在接触耐受化剂后24小时、48小时或72小时内，优选地48小时内，最优选地24小时内检测。在多发性硬化中，PD-L1的APC表达减少和促炎性细胞因子的分泌增加与MS患者的进展相关(Karni A.等(2006)J Immunol.177(6):4196-202)。相反，用IFN-β疗法治疗MS显著增加了单核细胞和DC上的PD-L1表达，并且显著抑制了自体CD4T细胞活化(Schreiner B(2004)J Neuroimmunol.155:172-182.)。是多发性硬化(MS)的T细胞免疫疗法，它由从个体的外周血单核细胞扩增的自体髓鞘反应性T细胞库构成。如本文所公开，产品的效价可通过监测抗原呈递细胞对暴露作出的应答而表达的PD-L1来测试。具体地讲，作为与产品一起培养作出的应答，PD-L1表达在应答者单核细胞中诱导。这些上述观察结果支持抗原呈递细胞的致耐受性标志物如包含PD-1配体(如，PD-L1)的致耐受性标志物的表达检测作为治疗剂的致耐受性测定方法。治疗剂因此，在一个方面，本专利技术提供用于测定治疗剂的致耐受性的方法。如本文所用，术语“致耐受性”是指治疗剂“耐受化”或诱导对特定抗原的“耐受性”的能力。术语“耐受性”是指对具体抗原的适应性免疫应答如T细胞和/或抗体应答的减少。对具体抗原的免疫应答的减少可伴随着免疫调节细胞如抗独特型和/或抗工效型免疫细胞的特殊子集的敏感化和/或应答增加。技术人员将认识到，治疗剂的致耐受性可与治疗剂的效价相关。如本文所用，“效价”是指治疗剂在施用后产生所需效果的能力。在优选的实施方案中，治疗剂的所需效果是对特定抗原(如，过敏原、自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定治疗剂的致耐受性的方法，所述方法包括：a.使所述治疗剂体外接触包含测试抗原呈递细胞的试样；b.测量接触所述治疗剂的所述测试抗原呈递细胞对包括PD‑1配体的至少一个致耐受性标志物的表达，其中所述测量步骤在所述接触步骤后72小时内进行；以及c.将所述测试抗原呈递细胞对所述至少一个致耐受性标志物的表达与适当的对照比较；其中与对照抗原呈递细胞相比，所述测试抗原呈递细胞对所述至少一个致耐受性标志物的表达增加确定所述治疗剂具有致耐受性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.24 US 61/931,4701.一种测定治疗剂的致耐受性的方法，所述方法包括：a.使所述治疗剂体外接触包含测试抗原呈递细胞的试样；b.测量接触所述治疗剂的所述测试抗原呈递细胞对包括PD-1配体的至少一个致耐受性标志物的表达，其中所述测量步骤在所述接触步骤后72小时内进行；以及c.将所述测试抗原呈递细胞对所述至少一个致耐受性标志物的表达与适当的对照比较；其中与对照抗原呈递细胞相比，所述测试抗原呈递细胞对所述至少一个致耐受性标志物的表达增加确定所述治疗剂具有致耐受性。2.如权利要求1所述的方法，其中所述测量步骤在所述接触步骤后约24小时进行。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包含T细胞，并且所述测试和对照抗原呈递细胞是所述T细胞自体的。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包含T细胞，并且所述测试和对照抗原呈递细胞是所述T细胞异体的。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞对选自由过敏原和自体抗原组成的组的抗原具有反应性。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·西雷，L·W·克里森，
申请(专利权)人：欧普萨治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US