本发明专利技术公开了一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法。质粒以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框，质粒用分子生物学方法构建，且DDDDK与丝素轻链基因polyA之间含有ApaI和NheI专一性的两个酶切位点，采用ApaI和NheI双酶切通用型质粒，与T4连接酶基因连接后，与辅助质粒共同注射到家蚕受精卵内，利用转座子特性使绿色荧光蛋白基因和T4连接酶基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，获得转基因家蚕。本发明专利技术借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌T4连接酶蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种质粒及其应用与方法，尤其是涉及一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法。
技术介绍
piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。PiggyBac转座系统是一种非病毒载体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb，可以实现多基因的共表达，且转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子(Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(Ser1Promoter)表达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。但纵观十几年来国内外家蚕生物反应器的研究结果，转基因家蚕丝腺生物反应器的外源蛋白表达效率都很低，不管是丝胶启动子驱动表达的外源基因，还是丝素启动子驱动表达的外源基因，极大多数实验的表达量都没有在达到茧层量的1％左右，远远没有达到科学家们期望的象表达蚕丝蛋白那样的高效表达水平。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提出了一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法，利用转基因家蚕技术将T4连接酶基因导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌单一的T4连接酶的家蚕。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：一、一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒：所述质粒为piggy-9887质粒，其碱基序列如SEQ ID NO.1，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框。一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、18s rRNA启动子、丝
素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点DDDDK、T4连接酶基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Ser1promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-T4Ligase-Fibroin L chain PolyA。所述的piggy-9887质粒是利用Ser1promoter和18s rRNA promoter双启动子驱动T4连接酶基因的表达。二、一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的制备方法，包括以下步骤：1)以带有ApaI酶切位点序列的T4连接酶-5’端序列和带有NheI酶切位点序列的T4连接酶-3’端序列为引物，以含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝胶基因启动子-T4连接酶基因-SV40([A3-EGFP-SV40]-[Ser promoter-T4Ligase-SV40])的piggy-10522质粒为模板，piggy-10522质粒的碱基序列如SEQ ID NO.2，通过PCR扩增获得长度为1536bp的T4连接酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.3；2)用ApaI和NheI双酶切piggy-8363质粒，piggy-8363质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4，得到长度为8361bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA]和Amp抗性基因的基因序列；3)连接步骤1)得到的T4连接酶基因和步骤2)得到的基因序列，得到含有[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His 6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]和Amp抗性基因的PiggyBac-9887质粒，其碱基序列如SEQ ID NO.1。三、本专利技术所述通用型质粒在T4连接酶表达的应用。四、一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒表达T4连接酶的方法，步骤如下：采用分子生物学方法构建包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-DDDDK-T4Ligase-FLPA]的piggy-9887质粒(其碱基序列如SEQ ID NO.1)作为在家蚕中部丝腺中表达T4连接基因的载体，该质粒以piggyBac转座子为基础包含有作为外源基因的T4连接基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因表达框；(1)采用显微注射的方法，将所述piggy-9887质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggy-9887质粒中的piggyBac转座子将T4连接酶基因插入到家蚕基因组内；(2)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代一龄第二天，通过荧光体视显微镜观察筛选出体色表达绿色荧光EGFP标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；(3)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达绿色荧光EGFP标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；(4)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达绿色荧光EGFP标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；(5)从G4代开始并经连续3代采用绿色荧光蛋白表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成绿色荧光基因和T4连接酶基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌T4连接酶的转基因家蚕；(6)通过家蚕丝腺细胞合成分泌T4连接，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。所述piggy-9887质粒是利用Ser1promoter和18s rRNA promoter双启动子驱动T4连接酶基因的表达。所述步骤(6)的T4连接酶基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。本专利技术是先构建家蚕合成分泌T4连接酶基因的piggy-9887载体(如图1所示)，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(如图2所示)一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和T4连接酶基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕丝腺细胞特异性合成分泌T4连接酶的转基因家蚕，自交使T4连接酶基因纯合，育成能分泌T4连接酶的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌T4连接酶。本专利技术具有的有益效果是：本专利技术借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌T4连接酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述质粒为piggy‑9887质粒，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框。
【技术特征摘要】
1.一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述质粒为piggy-9887质粒，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框。2.根据权利要求1所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3 Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点DDDDK、T4连接酶基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Ser1 promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-T4 Ligase-Fibroin L chain PolyA。3.根据权利要求2所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的piggy-9887质粒是利用Ser1 promoter和18s rRNA promoter双启动子驱动T4连接酶基因的表达。4.权利要求1～3任一所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)以带有ApaI酶切位点序列的T4连接酶-5’端序列和带有NheI酶切位点序列的T4连接酶-3’端序列为引物，以含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝胶基因启动子-T4连接酶基因-SV40([A3-EGFP-SV40]-[Ser promoter-T4 Ligase-SV40])的piggy-10522质粒为模板，piggy-10522质粒的碱基序列如SEQ ID NO.2，获得长度为1536bp的T4连接酶基因，T4连接酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.3；2)用ApaI和NheI双酶切piggy-8363质粒，piggy-8363质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4，得到长度为8361bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter-18s rRNA pro...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，张玉玉，叶露鹏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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