一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术的表达宿主是一种进入稳定期后菌体就自降解的枯草芽孢杆菌。该枯草芽孢杆菌在培养至进入稳定期以后，能够促进细胞裂解的蛋白分子就会在稳定期启动子的促进下过量表达，从而使宿主快速裂解，达到释放胞内物质的目的。利用本发明专利技术表达宿主表达了绿色荧光蛋白基因(gfp)，通过发酵培养，与利用传统的枯草芽孢杆菌标的宿主相比，最终的菌体浓度降低至少63.2％，而胞外荧光蛋白含量提高至少78.8％～141.5％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由于具有生长速度快、发酵周期短、胞外分泌蛋白能力强等特点，正在为应用生物学发挥着重要的作用。同时作为研究透彻模式菌株又是被普遍认为是安全的(GRAS)，已广泛应用于食品和药品的研究和生产中。但是，利用枯草芽孢杆菌过量表达某些酶分子和合成一些胞内代谢产物时，往往会出现这些产物本身性质的原因不能够大量的分泌到细胞外，而枯草芽孢杆菌由于其革兰氏阳性菌的特质，胞外具有很厚的肽聚糖层，破碎过程费时费力，且容易造成目标产物变性。因此，一种能够自降解的表达宿主对于生产胞内蛋白或分泌能力较差的产物具有很大的应用价值。
技术实现思路
为了满足目前利用枯草芽孢杆菌在生产代谢产物和酶制剂等过程中需要在稳定期自发裂解并释放胞内目的物质的需求，本专利技术提供了一种稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主，并将其应用至蛋白分子的表达。本专利技术的第一个目的是提供一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌载体，所述载体携带稳定期启动的启动子和由该启动子启动表达的自裂解蛋白的基因；所述编码自裂解蛋白的基因是由所述稳定期启动的启动子启动表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述稳定期启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQ ID NO.4～8所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体的出发载体为pAX01。本专利技术的第二个目的是提供一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌携带所述载体，在细胞进入稳定期后会发生自降解，从而释放胞内目的产物。本专利技术的第三个目的是提供所述稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌的制备方法，是构建携带稳定期启动的启动子和裂解蛋白基因的整合载体，再重组到枯草芽孢杆菌基因组上；所述稳定期启动的启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD；编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG。在一般培养条件下，菌体生长进入稳定期以前，该宿主中具有裂解细胞活性的蛋白不会表达。但进入稳定期后，在稳定期启动子的作用下开始表达，从而使细胞裂解。利用稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主对外源基因进行质粒表达，验证了该表达系统的有效性。在本专利技术的一种实施方式中，所述稳定期启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQ ID NO.4～8所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括：Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis131.1，Bacillus subtilis AG1839，Bacillus subtilis PY79，Bacillus subtilis BAB-1，Bacillus subtilisXF-1。在本专利技术的一种实施方式中，所述整合载体的出发载体为pAX01。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：1.构建携带稳定期启动子和自裂解蛋白基因的整合质粒：以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR获得稳定期启动子和自裂解蛋白的编码基因的DNA片段，通过酶切连接的方式插入到整合载体上，通过转化入相应的宿主，获得携带稳定期启动子和编码自裂解蛋白的基因的整合质粒。2.稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主的获得：将携带有稳定期启动子和编码自裂解蛋白基因的整合质粒转化至不含有整合质粒所携带抗性基因的宿主枯草芽孢杆菌中，在相应的抗性条件下筛选，获得稳定期自裂解枯草芽孢杆菌。该表达宿主的有效性的验证是以改造前的枯草芽孢杆菌作为表达宿主为对照的，通过与对照比较基因表达情况来验证有效性。步骤1中携带有稳定期启动子和裂解基因的整合质粒的具体构建方法如下：(1)稳定期启动子和自裂解蛋白的编码基因的DNA片段的获得：以Bacillus subtilis 168(Bacillus subtilis 168，获取自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心)基因组模板，PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组上PmmgA、PsigW和PyqfD三个稳定期启动子DNA片段，以及skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG五个自裂解蛋白编码基因的DNA片段。(2)整合质粒的构建：将PmmgA、PsigW和PyqfD启动子DNA片段和skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG五个基因的DNA片段通过双酶切后，分别与相同酶切处理过的pAX01质粒进行连接，再转入Escherichia coli JM109中，通过氨苄青霉素平板筛选和质粒测序验证，分别得到携带有稳定期启动子和裂解基因的整合质粒；具体为携带PmmgA的质粒pPMMGA-skfA、pPMMGA-sdpC、pPMMGA-xpf、pPMMGA-lytC和pPMMG-bsrG，携带PsigW的质粒pPSIGW-skfA、pPSIGW-sdpC、pPSIGW-xpf、pPSIGW-lytC和pPSIGW-bsrG，和携带PyqfD的质粒pPYQFD-skfA、pPYQFD-sdpC、pPYQFD-xpf、pPYQFD-lytC和pPYQFD-bsrG。步骤2中稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主的获得的具体方法如下：将上述15个整合质粒分别通过化学转化法转化进入枯草芽孢杆菌中，通过在红霉素平板上筛选，然后通过PCR的方法进行验证，得到15株稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主，分别命名为B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC、B.subtilis YBG。该表达宿主有效性的验证，可以选用各种外源基因进行表达验证，以荧光蛋白为例，验证方法如下：(1)表达质粒的构建：PCR扩增gfp基因片段，连接到pP43质粒上，构成新的质粒pP43-gfp并转入到Bacillus subtilis 168、B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG中。(2)筛选含有Bacillus subtilis 168(pP43-gfp)，B.subtilis 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌载体，其特征在于，携带稳定期启动的启动子和编码自裂解蛋白的基因；所述编码自裂解蛋白的基因是由所述稳定期启动的启动子启动表达。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌载体，其特征在于，携带稳定期启动的启动子和编码自裂解蛋白的基因；所述编码自裂解蛋白的基因是由所述稳定期启动的启动子启动表达。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述稳定期启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQ ID NO.4～8所示。4.根据权利要求1～3任一所述的载体，其特征在于，所述载体的出发载体为pAX01。5.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，携带稳定期自裂解的载体，所述稳定期自裂解的载体如权利要求1-4任一所述。6.权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，构建携带稳定期启动的启动子和裂解蛋白基因的整合载体，再重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，杨森，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32