本发明专利技术公开了一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：将由碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因组成的表达单元，通过同源重组整合到芽孢杆菌基因组中。本发明专利技术方法具体可为：将SEQ ID NO.5所示序列通过限制性内切酶SacI、XbaI及DNA连接酶连接到pHT01载体上构建同源重组载体；用所构建的同源重组载体转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945a，筛选同源重组成功的菌株。通过本发明专利技术方法可以得到在碱性条件下高效表达纤维素外切酶的芽孢杆菌。本发明专利技术实现了纤维素外切酶在芽孢杆菌中的碱控表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法。
技术介绍
纤维素酶在对生物资源的利用方面具有巨大的价值。纤维素酶能降解天然的纤维素，转化成葡萄糖，进而生产多种化工原料或生物制品。如果生产纤维素酶的菌株能够耐受较高的碱度，那么可以实现一边用碱降解纤维素，一边用微生物在碱性条件下生产纤维素酶降解纤维素。芽孢杆菌能在碱性条件进行正常的生长繁殖，而且芽孢杆菌是一种食品安全的微生物，若用芽孢杆菌生产纤维素酶，这样芽孢杆菌不仅可以碱性体系下持续表达纤维素酶，而且不需要进行分离纯化把芽孢杆菌去除掉。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法。本专利技术的目的还在于提供一种在碱性条件下表达纤维素外切酶的芽孢杆菌。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法，包括如下步骤：将由碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因组成的表达单元，通过同源重组整合到芽孢杆菌基因组中，实现芽孢杆菌在碱性条件下高效表达纤维素外切酶。所述的芽孢杆菌优选为地衣芽孢杆菌；所述的碱性条件优选为pH为8至9；所述的纤维素外切酶编码基因优选来源于黑曲霉。所述的碱性启动子的序列优选如SEQ ID NO.1所示；所述的SD序列优选如SEQ ID NO.2所示；所述的信号肽编码序列优选如SEQ ID NO.3所示；所述的纤维素外切酶编码基因的序列优选如SEQ ID NO.4所示。优选的，所述的增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.5所示序列通过限制性内切酶SacI、XbaI及DNA连接酶连接到pHT01载体上构建同源重组载体；用所构建的同源重组载体转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945a，筛选同源重组成功的菌株。一种在碱性条件下表达纤维素外切酶的芽孢杆菌，通过上述方法得到。本专利技术以芽孢杆菌作为表达宿主，通过同源重组将由碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因组成的表达单元整合到其基因组上，从而让芽孢杆菌在碱性条件下高效表达纤维素外切酶。本专利技术实现了纤维素外切酶在芽孢杆菌中的碱控表达。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例11、材料地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）ATCC 9945a，大肠杆菌DH5α，质粒pHT01， SEQ ID NO.5所示的DNA序列1（包括上下游同源臂、碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因，由生物公司合成）。质粒提取试剂盒（B518188）购自上海生物工程股份有限公司。胶回收试剂盒（Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）、限制性内切酶和T4 DNA Ligase购自Takara公司。LB培养基：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L；酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl） 10g/L。2、质粒pHT01的提取含有质粒pHT01的大肠杆菌DH5α，在含氯霉素5mg/L的LB培养基中培养12h，培养温度为30℃，用质粒提取试剂盒（B518188）提取质粒。提取步骤如下：（1）取0.5mL菌液，10000rpm离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。（2）在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。（3）将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（6）重复向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（7）将吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。（8）将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，8000rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存。3、质粒pHT01和SEQ ID NO.5所示DNA序列1的酶切往25µL提取的质粒pHT01中加入SacI和XbaI酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到质粒pHT01酶切液。DNA序列1用双蒸水稀释10倍，取25µL，加入SacI和XbaI酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到DNA序列1酶切液。4、酶切液电泳（1）电泳试剂配制1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，将pH调到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用时稀释5倍。2）加样缓冲液的配制：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。3）溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10mL水，配成终浓度为10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其终浓度为0.5μg/mL，混合均匀。4）100×TE缓冲液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。称取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20mL），然后定容至1000mL。5）100×电泳缓冲液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸钠，200mmol/L EDTA。称取Tris 242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用时稀释100倍。（2）电泳方法1）安装电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀。3）灌胶：将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。4）待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。5）加样：将DNA样品与加样缓冲液按体积比4:1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20μL，记录样品的点样次序和加样量。6）电泳：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法，其特征在于：包括如下步骤：将由碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因组成的表达单元，通过同源重组整合到芽孢杆菌基因组中。
【技术特征摘要】
1.一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法，其特征在于：包括如下步骤：将由碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因组成的表达单元，通过同源重组整合到芽孢杆菌基因组中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的碱性条件为pH8-9。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的纤维素外切酶编码基因来源于黑曲霉。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的碱性启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的SD序列如SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，梁龙元，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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