【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传工程的细胞修饰，尤其是涉及一种永生化胰腺导管腺癌癌相关成纤维细胞系及其构建与应用。
技术介绍
1、从肿瘤组织分离的原代细胞通常可以在适当的条件下体外生长、分裂，但是经过有限次数的传代后，随着染色体的dna的不断复制，染色体末端的端粒便会不断地缩短，端粒的长度具有一定的阈值，端粒缩短到一定程度就不能再缩短，这时细胞会出现不能分裂的现象，此时细胞增殖能力明显变弱，进而衰老和死亡。这样限制了体外培养原代细胞的进一步应用。
2、为了给基础和临床研究提供标准的细胞系，科学家们提出了多种方法构建能够永生化的细胞。所谓“永生化”是指细胞继续其连续的细胞周期，完成其发育过程。细胞获得无限的增殖能力。建立永生化细胞至少具有以下优点：细胞分化、生长和增殖之间的关系可以在体外进行研究。为组织工程和基因治疗等提供了有效的细胞模型；此外，它们还可以用作药理学或毒理学研究的标准细胞，有利于实验结果的比较。每个实验室的组织细胞来源、培养方法和传代差异很大，因此通过标准的永生化步骤和流程得到的永生化细胞可以使试验采用的组织细胞保持更好的同质性。
3、在所有永生化细胞的技术中最稳定、效率最高的方法是给细胞转染入端粒酶。端粒是由一个短的多重复非转录序列(ttaggg)和一些结合蛋白构成一个特殊的结构，端粒除了为非转录dna提供缓冲外，它还能维持染色体的末端长度，同时在染色体复制、定位、保护和控制细胞生长和寿命的方面发挥了重要作用，并且端粒与细胞凋亡和永生化也有着密切关系。当细胞每分裂一次时，细胞的每个染色体的端粒都会慢慢变
4、永生化的癌相关成纤维细胞具有无限增殖但不改变细胞形态以及功能不衰退的特性。因此，将癌相关成纤维细胞永生化不仅可以免除原代培养时的繁琐，节约成本，更为今后更好地利用成纤维细胞，提供了便捷的方式；并且以永生化的成纤维细胞也可以作为基础的细胞模型，去探索肿瘤发生、发展、侵袭转移等生物学背后的机制。
5、相比于市面上已商业化的其他永生化非肿瘤来源的成纤维细胞，肿瘤来源的成纤维细胞由于受到肿瘤微环境中其他细胞成分及物质的影响，使得其生物学表现异于正常成纤维细胞，这导致了癌相关成纤维细胞对于质粒转染并不敏感，所以目前还没有能商业化的产品出现。
6、因此，提供一种永生化癌相关成纤维细胞系仍然是至关重要的。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种永生化胰腺导管腺癌癌相关成纤维细胞系及其构建与应用。
2、人类端粒酶主要成分是端粒rna(hμman telomerase rna,htr)，端粒酶逆转录酶(hμman telomerase reverse transcriptase,tert)以及人端粒酶相关蛋白(hμmantelomerase-associated protein,htp)，其中htr是端粒酶逆转录的dna模板，端粒酶利用自身的htr为模板合成端粒dna序列，进而维持染色体端粒长度，htr与htp共同作业才维持了端粒的长度与端粒酶的活性。tert是端粒酶的重要组成部分，主要分布在细胞核中。端粒酶活性主要受tert和htr基因控制。tert编码端粒酶的逆转录酶，htr主要为端粒酶复制提供dna模板。研究发现，人tert在正常细胞中是不表达或少量表达的，但htr却是正常表达，但人tert和htr在癌细胞或肿瘤细胞中均表达。因此，可以确定tert是维持端粒长度和结构并促进细胞增殖的关键。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本专利技术的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤：
5、用含有包装有人端粒酶反转录酶的质粒的转染体系转染癌相关成纤维细胞系原代细胞，筛选后进行扩大培养，得到永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系；
6、其中，人端粒酶反转录酶为tert，质粒载体为gv348质粒；包装有人端粒酶反转录酶的质粒为gv348-tert质粒；
7、转染体系包括质量比为1.5：0.5：2的pspax2、pmd2.g和gv348-tert。
8、在本专利技术的一个实施方式中，扩大培养过程中，所用培养基为含成纤维细胞生长因子和胎牛血清的人成纤维细胞扩增基础培养基。
9、在本专利技术的一个实施方式中，所述纤维细胞生长因子为氢化可的松和人重组egfr生长因子的混合物。
10、在本专利技术的一个实施方式中，人成纤维细胞扩增基础培养基中，氢化可的松的浓度为400ng/ml～600ng/ml，人重组egfr生长因子的浓度为4ng/ml～6ng/ml，胎牛血清的质量分数为8％～12％；
11、优选地，人成纤维细胞扩增基础培养基中，氢化可的松的浓度为500ng/ml，人重组egfr生长因子的浓度为5ng/ml，胎牛血清的质量分数为10％。
12、在本专利技术的一个实施方式中，转染48h后通过3～6μg/ml的puromycindihydrochloride抗生素进行筛选；
13、通过5μg/ml的puromycin dihydrochloride抗生素进行筛选。
14、在本专利技术的一个实施方式中，扩大培养过程中，培养时间为5～9天；
15、扩大培养过程中，培养时间为7天。
16、在本专利技术的一个实施方式中，利用qrt-pcr进行永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的验证，其中，使用的正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，使用的反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，使用的内参照β-actin正向引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，使用的内参照β-actin反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
17、本专利技术的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的永生化胰腺导管腺癌癌相关成纤维细胞系。
18、本专利技术的第三个目的是提供一种永生化胰腺导管腺癌癌相关成纤维细胞系在肿瘤学生物学研究中的应用。
19、本专利技术发现从肿瘤组织标本中分离出的原代细胞不能长期稳定传代，而一般认为细胞缺乏端粒酶导致分裂过程中端粒长度不断丢失是细胞衰老的机制之一。端粒酶是维持永生化的最要因素，端粒酶的活性受到tert的活性的影响，当tert活性增加时端粒酶活性便会增加，端粒酶端便会以自身携带的rna为复制模板，以端粒3’末端单链dna为引物，不依赖dna聚合酶。逆转录合成端粒dna序列加到染色体3’末端，弥补了染色体复制导致的端粒的缺失稳定了染色体长度的稳定，从而达到永生化的目的。tert基因相对于某些病毒基因病毒、原癌基因等永生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，扩大培养过程中，所用培养基为含成纤维细胞生长因子和胎牛血清的人成纤维细胞扩增基础培养基。
3.根据权利要求2所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子为氢化可的松和人重组EGFR生长因子的混合物。
4.根据权利要求3所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，人成纤维细胞扩增基础培养基中，氢化可的松的浓度为400ng/mL～600ng/mL，人重组EGFR生长因子的浓度为4ng/mL～6ng/mL，胎牛血清的质量分数为8％～12％。
5.根据权利要求4所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，人成纤维细胞扩增基础培养基中，氢化可的松的浓度为500ng/mL，人重组EGFR生长因子的浓度为5ng/mL，胎牛血清的质量分数为10％。
6.根据权利要求5所述的一种永
7.根据权利要求6所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，通过5μg/mL的Puromycin Dihydrochloride抗生素进行筛选。
8.根据权利要求1所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，扩大培养过程中，培养时间为5～9天。
9.一种通过权利要求1～8任一所述方法制备得到的永生化胰腺导管腺癌癌相关成纤维细胞系。
10.一种如权利要求9所述的永生化胰腺导管腺癌癌相关成纤维细胞系在肿瘤学生物学研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，扩大培养过程中，所用培养基为含成纤维细胞生长因子和胎牛血清的人成纤维细胞扩增基础培养基。
3.根据权利要求2所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子为氢化可的松和人重组egfr生长因子的混合物。
4.根据权利要求3所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，人成纤维细胞扩增基础培养基中，氢化可的松的浓度为400ng/ml～600ng/ml，人重组egfr生长因子的浓度为4ng/ml～6ng/ml，胎牛血清的质量分数为8％～12％。
5.根据权利要求4所述的一种永生化胰腺导管腺癌癌相关纤维细胞系的构建方法，其特征在于，人成纤维细胞扩增基础培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：虞先濬，施思，雷雅岚，戎泽印，徐近，王巍，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。