包含肽微基因表达系统的基于李斯特菌的组合物及其使用方法技术方案

本公开提供包含含有微基因表达构建体的李斯特菌递送载体的组合物，以及将所述组合物用于诱导针对抗原表达性肿瘤或癌症的免疫应答和用于治疗所述肿瘤或癌症的方法，和针对具有所述肿瘤的受试者中的肿瘤进行疫苗接种的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含肽微基因表达系统的基于李斯特菌的组合物及其使用方法
本文公开了包含含有微基因表达构建体的李斯特菌递送载体的组合物，以及将所述组合物用于诱导针对抗原表达性肿瘤或癌症的免疫应答和用于治疗所述肿瘤或癌症的方法，和针对具有所述肿瘤或癌症的受试者中的肿瘤或癌症进行疫苗接种的方法。
技术介绍
单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是主要感染抗原呈递细胞并且已适应在这些细胞的细胞质中生活的细胞内病原体。宿主细胞诸如巨噬细胞、主动吞噬细胞单核细胞增多性李斯特菌和大部分细菌在吞噬溶酶体中降解。一些细菌通过溶血素、李斯特菌溶血素O(LLO)的作用刺穿噬菌溶酶体膜而逃入宿主胞质溶胶。一旦处于胞质溶胶中，单核细胞增多性李斯特菌即可使宿主肌动蛋白聚合，并且直接从细胞传递到细胞，从而进一步入侵宿主免疫系统并产生可忽略的对单核细胞增多性李斯特菌的抗体应答。从李斯特菌进行的重组蛋白表达已涉及将编码包含所关注的抗原性序列的全长蛋白或大多肽的DNA序列引入，但是这在希望从异源性来源表达多个肽决定簇的情况下是不可能的。在此情况下，肽作为包含被不同长度的氨基酸接头分开的所关注肽的单个多肽构建体而表达，并且这些肽需要蛋白酶体活性以产生MHCI类结合肽决定簇。这可导致抗原呈递的丧失。因此，需要避开蛋白酶体活性并增强抗原呈递，以便提升免疫应答。本公开通过提供基于李斯特菌的组合物而解决这一需求，所述组合物包含核酸序列的“微基因”表达系统，所述核酸序列编码最小肽决定簇以通过MHCI类分子呈递。这些微基因可通过紧接在ubiquitin部分之后的肽(Ub-肽)表达，并且这样的话，该系统就规避了对抗原进入抗原加工通路的需求，从而使得肽抗原可直接表达进被重组李斯特菌感染的细胞的胞质溶胶中。另外，且如本文所公开的具体实施方式中所述，本公开的微基因系统提供使得可以使用单个李斯特菌递送载体将多个肽载入细胞中的优点。
技术实现思路
在一个方面，本公开提供包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌菌株，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列；b.泛素(Ub)蛋白；c.肽；并且其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。在另一方面，本公开提供引起具有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤或抗癌应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列；b.泛素(Ub)蛋白；c.肽；并且其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。在一个方面，本公开提供治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列；b.泛素(Ub)蛋白；c.肽；并且其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。附图说明本专利或申请文件包含至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。被视为本公开的主题在说明书的结论部分特别指出并明确要求进行保护。然而，在结合附图阅读时，通过参考以下具体实施方式，可以最好地理解本专利技术(对组织和操作方法来说皆是如此)及其目的、特征和优点，在附图中：图1A-B显示Lm-E7和Lm-LLO-E7使用不同的表达系统来表达和分泌E7。通过将基因盒引入单核细胞增多性李斯特菌基因组的orfZ域中来产生Lm-E7(图1A)。hly启动子驱动hly信号序列和LLO的前五个氨基酸(AA)以及随后的HPV-16E7的表达(图1B)。通过以质粒pGG-55转化prfA-菌株XFL-7来产生Lm-LLO-E7。pGG-55具有驱动LLO-E7非溶血性融合体的表达的hly启动子。pGG-55也含有prfA基因，以选择XFL-7在体内对质粒的保留。图2显示Lm-E7和Lm-LLO-E7分泌E7。使Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)和10403S(泳道6)在Luria-Bertoni液体培养基中于37℃生长过夜。沉淀相等数目的细菌(通过600nm处吸光度OD确定)，并将18ml的每种上清液进行TCA沉淀。通过Western印迹分析E7表达。用抗E7mAb、随后用HRP-偶联的抗小鼠(Amersham)探测该印迹，接着使用ECL检测试剂显影。图3显示LLO-E7融合体的肿瘤免疫治疗功效。显示了肿瘤接种后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米计的肿瘤大小。未暴露的小鼠：空心圆圈；Lm-LLO-E7：实心圆圈；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；和Lm-LLO-NP：实心三角形。图4显示来自Lm-LLO-E7-免疫的小鼠的脾细胞在暴露于TC-1细胞时增殖。将C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或对照rLm菌株免疫和强化。在强化后6天收获脾细胞，并以显示的比率与经照射的TC-1细胞一起铺板。将细胞用3H胸苷脉冲处理并收获。将Cpm定义为(实验cpm)-(无TC-1对照)。图5A显示，(A)Western印迹证实Lm-ActA-E7分泌E7。泳道1：Lm-LLO-E7；泳道2：Lm-ActA-E7.001；泳道3；Lm-ActA-E7-2.5.3；泳道4：Lm-ActA-E7-2.5.4。图5B显示施用Lm-ActA-E7(矩形)、Lm-E7(椭圆形)、Lm-LLO-E7(X)和未暴露的小鼠(未接种疫苗；实心三角形)的小鼠中的肿瘤大小。图6A显示用于制备4种LM疫苗的质粒插入片段的示意图。Lm-LLO-E7插入片段含有所有使用的李斯特菌基因。它含有hly启动子、hly基因(其编码蛋白LLO)的前1.3kb和HPV-16E7基因。hly的该前1.3kb包括信号序列(ss)和PEST区域。Lm-PEST-E7包括hly启动子、信号序列以及PEST和E7序列，但是不包括截短的LLO基因的剩余部分。Lm-ΔPEST-E7不包括PEST区域，但是含有hly启动子、信号序列、E7和截短的LLO的剩余部分。Lm-E7epi仅具有hly启动子、信号序列和E7。图6B上部插图：含有PEST区域的李斯特菌构建体诱导肿瘤消退。下部插图：在2个单独实验中肿瘤挑战后第28天时的平均肿瘤大小。图6C显示含有PEST区域的李斯特菌构建体在脾中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。显示了来自3个实验的数据的平均值和SE。图7A显示，在施用TC-1肿瘤细胞并随后以Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7施用的或无疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中E7特异性的分泌IFN-γ的CD8+T细胞的诱导和浸润肿瘤的数目。图7B显示，针对(A)描述的小鼠的脾和肿瘤中E7特异性的CD8+细胞的诱导和浸润。图8A-B显示，含有PEST区域的李斯特菌构建体在肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌菌株，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列，b.泛素(Ub)蛋白，c.肽，其中a.‑c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.03 US 62/127,6141.一种包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌菌株，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列，b.泛素(Ub)蛋白，c.肽，其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置。2.根据权利要求1所述的重组李斯特菌，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述肽包含一个或多个新表位。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组李斯特菌，其中每个开放阅读框包含不同的肽。6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述微基因构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。7.根据权利要求6所述的重组李斯特菌，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述细菌分泌信号序列为包含SEQIDNO:4的得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变或缺失。11.根据权利要求10所述的重组李斯特菌，其中李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充所述dal/dat基因组突变或缺失。12.根据权利要求11所述的重组李斯特菌，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。13.根据权利要求11所述的重组李斯特菌，其中所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。14.根据权利要求11至13中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。15.根据权利要求11至14中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述微基因构建体整合进所述李斯特菌基因组或在所述李斯特菌的染色体外质粒中。16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在actA基因中包含基因组突变或缺失。17.根据权利要求1至16中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在inlB基因中包含基因组突变或缺失。18.根据权利要求1至17中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组李斯特菌在prfA基因中包含基因组突变或缺失。19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述重组减毒李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。20.一种药物组合物，包含根据权利要求1至19中任一项所述的重组李斯特菌和药学上可接受的载体。21.一种引起具有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤或抗癌应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列，b.泛素(Ub)蛋白，c.肽，其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述肽包含一个或多个新表位。25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中每个开放阅读框包含不同的肽。26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述微基因构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列为得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌菌株的染色体中突变或缺失的内源性基因。32.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。33.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中所述微基因构建体整合进所述李斯特菌基因组或在所述李斯特菌的染色体外质粒中。36.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在actA基因中包含基因组突变或缺失。37.根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在inlB基因中包含基因组突变或缺失。38.根据权利要求21至37中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在prfA基因中包含基因组突变或缺失。39.根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。40.根据权利要求21至39中任一项所述的方法，还包括施用独立的佐剂。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。42.根据权利要求21至41中任一项所述的方法，其中所述癌症包括淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、胰腺导管腺癌、骨肉瘤、胃癌、非小细胞肺癌或骨癌。43.根据权利要求21至42中任一项所述的方法，其中所述癌症为难治性癌症。44.根据权利要求42所述的方法，其中所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。45.根据权利要求42所述的方法，其中所述淋巴瘤为多发性骨髓瘤。46.一种治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组李斯特菌的步骤，所述重组李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：a.细菌分泌信号序列，b.泛素(Ub)蛋白，c.肽，其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述肽从氨基末端到羧基末端分别串联布置，从而增强所述受试者中的抗肿瘤应答。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述李斯特菌还包含由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。48.根据权利要求46所述的方法，其中所述李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一至四个开放阅读框。49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述肽包含一个或多个新表位。50.根据权利要求46至49中任一项所述的方法，其中每个开放阅读框包含不同的肽。51.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述微基因表达核酸构建体还包含驱动所述核酸构建体的表达的5’细菌启动子。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述启动子为actA启动子、hly启动子或p60启动子。53.根据权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列编码包含ActA蛋白信号序列的前100个氨基酸的ActA100信号序列。54.根据权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述细菌分泌信号序列为得自李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的分泌信号序列。55.根据权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌在D-丙氨酸消旋酶(dal)和D-氨基酸转移酶(dat)基因中包含基因组突变。56.根据权利要求46至55中任一项所述的方法，其中李斯特菌还包含含有编码代谢酶的第一开放阅读框的核酸分子，并且其中所述代谢酶补充在所述重组李斯...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·珀蒂，麦可·F·宾矽欧塔，
申请(专利权)人：阿德瓦希斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US