本发明专利技术公开了一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过分子生物学手段从生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)中克隆获得磷脂酶D基因，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，通过卡那霉素抗性平板筛选获得表达载体高拷贝重组的含磷酸酶工程菌。并将重组磷脂酶D用于转化磷脂酰胆碱和丝氨酸生产磷脂酰丝氨酸，实现维生素C‑2‑磷酸酯的高效生产。在40℃、pH4.5的条件下反应2h，磷脂酰丝氨酸产量可达15.8g/L，转化率为63.9％，时空产率为7.9g/L/h。
Recombinant Escherichia coli producing phospholipase D and its application
The invention discloses a recombinant Escherichia coli producing phospholipase D and its application, which belongs to the field of biological engineering technology. The present invention by means of molecular biology from two in Streptomyces (Streptomyces ambofaciens) cloned phospholipase D gene. The constructed expression plasmid into E.coli BL21 (DE3), by KMR screening for expression of phosphatase high copy recombinant engineering bacteria carrier. And the recombinant phospholipase D for conversion of phosphatidylcholine and phosphatidylserine serine production, the vitamin C 2 phosphate production. Under the conditions of 40 2H and pH4.5, the yield of phosphatidylserine reached 15.8g/L, the conversion rate was 63.9%, and the space-time yield was 7.9g/L/h.
【技术实现步骤摘要】
一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用
本专利技术涉及一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程和蛋白质工程
技术介绍
磷脂酰丝氨酸(phophatidylserine，PS)是一种构成哺乳动物、高等植物和微生物细胞的重要的膜磷脂。在生理调节方面，PS传递神经讯息、调节体内代谢过程、调节与膜蛋白互作的酶的活性；在功效价值方面，PS能够改善老年痴呆症、抗抑郁、舒缓压力、提高记忆力和认知力。目前制备PS的方法有有机溶剂萃取法、化学合成法和生物酶转化法。化学合成难度大、产物成分复杂、分离提纯困难，因此还处于试验研究阶段。萃取法是目前工业化生产PS的主要方法。其原理是以富含PS的动、植物细胞，如牛脑、大豆等为原料，以有机溶剂萃取、浓缩。然而，以动物脑为原料提取PS时存在致病隐患，由此而得到的PS的安全性受到质疑。而以大豆为原料进行萃取还存在萃取过程不环保、干扰物质种类多等问题。酶转化法是利用磷脂酶D(phospholipaseD，PLD)的转磷脂酰活性，卵磷脂提供磷脂基质，L-丝氨酸(L-Ser)作为醇供体，合成PS。生物合成PS具有生产成本低、反应效率高、条件温和的优势，由此得到的PS高纯度、多功效、无毒副作用，而具有更广阔的应用前景，磷脂酶D(EC3.1.4.4)，最先于1947年在卷心菜、花生中被发现，随后的研究发现PLD广泛存在于动、植物和微生物细胞内，其中以微生物来源的、同时是链霉菌属来源的PLD表现出更好的转磷脂酰活性。目前PLD的生产主要采取微生物发酵法。然而链霉菌的产酶周期长(5-7天)、生产强度低、培养成本高，不利于实际工业生产。
技术实现思路
为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术利用大肠杆菌异源表达PLD基因，实现酶在短时间内的大量表达纯化，以大大提高生产效率，降低生产成本。本专利技术的第一个目的是提供一种高产磷脂酶D的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶D。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D由SEQIDNO.2所示基因编码。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D由pET28a(+)为载体进行表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α、或E.coliTOP10。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。本专利技术的第二个目的是提供一种构建高产磷脂酶D重组菌的方法，所述方法是将来源于产二素链霉菌的编码磷脂酶D的基因与载体连接，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码磷脂酶D的基因如SEQIDNO.2所示，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因编码的重组蛋白N端引入6个连续的组氨酸标签。在本专利技术的一种实施方式中，所述构建高产磷酸酶的重组菌具体包括如下步骤：以pET28a(+)为载体，将SEQIDNO.2所示基因与载体连接，在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中重组表达SEQIDNO.1所示磷脂酶D。本专利技术的第三个目的是提供一种重组磷脂酶D的制备方法，所述方法将所述重组菌培养至OD600为0.6-1.0，以IPTG为诱导剂，表达磷脂酶D。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌培养至OD600为0.6-1.0，加入终浓度为0.4～0.6mMIPTG后，在25～28℃诱导1～4h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌培养至OD600为0.6-1.0，加入终浓度为0.4mMIPTG后，在25℃下进行诱导2h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还将磷脂酶D进行纯化，所述纯化将所述重组菌细胞破碎，选用亲和镍柱层析纯化磷脂酶D，分别用10、20、50mM的咪唑洗去杂蛋白，再以300、500mM浓度的咪唑洗脱目标蛋白，透析脱盐后，采用10kDa超滤浓缩管获得纯磷脂酶D蛋白。本专利技术的第四个目的是提供应用所述磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法，所述方法是以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物，应用SEQIDNO.1所示磷脂酶D转化底物生产磷脂酰丝氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D的形式为酶液或载有产磷脂酶D的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化条件是：pH4～9，转化温度30～60℃，转化时间2～8h。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化在摇床中进行，摇床转速为200～220rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化体系是：大豆卵磷脂浓度为0.1～0.4mol，L-ser浓度为0.5～2.0mol，用所述重组菌的冻干状态进行转化：酶粉添加量为20～100mg/molPC。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D经过冷冻干燥机冻干。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化体系是：大豆卵磷脂浓度为0.1mol，L-ser浓度为0.5mol，加入纯化后的磷脂酶D用于转化反应。本专利技术还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括制备含磷脂酰丝氨酸的食品、药品或保健品。有益效果：1、本专利技术所述的磷脂酶D属于碱性磷脂酶家族，具有较高的水解和转磷脂酰活性。2、本专利技术将来源产二素链霉菌的磷脂酶D基因异源表达于大肠杆菌中，经过生产优化，解决了包涵体的问题，磷脂酶D表现出相对较高的活力，可以更好地满足工业生产的需求。在40℃、pH4.5的条件下反应2h，磷脂酰丝氨酸产量可达15.8g/L，转化率为63.9％，时空产率为7.9g/L/h。附图说明图1为蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图；M：marker；1：BL21对照菌株；2：表达优化后PLD1破碎上清；3：表达优化前PLD1破碎上清；4：表达优化前PLD1破碎沉淀；图2为蛋白表达及纯化SDS-PAGE电泳图；M：marker；1：纯化后PLD1；2：纯化前PLD1；图3为PLD1在不同pH下的酶活；图4为PLD1在不同温度下的酶活。具体实施方式酶活定义：在50℃下，pH8.0，每分钟每生成1μmol胆碱所需的酶量为一个酶活单位。待测样品预处理：去转化液10000rpm离心5min，收集上层有机相，旋转蒸发后用流动相重新溶解样品。以磷脂酰丝氨酸、磷脂酸胆碱、磷脂酸钠盐为标准品，配置标准溶液。将适度稀释的样品和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和剩余磷脂酰胆碱的含量。磷脂酰丝氨酸含量的测定：采用高效液相色谱法。色谱柱：DIOL(250mm×4mm，5μm)；流动相：正己烷/异丙醇/1％冰醋酸＝8：8：1(v：v：v)，用0.22μm滤膜过滤；柱温：30℃；检测波长：210nm；进样量：20μL；流速:1mL/min。时空产率的计算：时空产率(g/L/h)＝PS产量(g/L)/转化时间(h)实施例1：重组磷脂酶D基因工程菌的构建(1)设计引物，通过分子生物学手段用SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示的引物将来源于Streptomycesambofaciens的磷脂酶D基因(SEQIDNO.2所示)进行PCR扩增：体系中加入LAtaq酶，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产磷脂酶D的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶D；所述磷脂酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种高产磷脂酶D的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶D；所述磷脂酶D的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述磷脂酶D由pET系列载体进行表达。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α或E.coliTOP10。4.一种构建权利要求1所述高产磷脂酶D的基因工程菌的方法，其特征在于，将编码磷脂酶D的基因与载体连接，在宿主大肠杆菌中重组表达；所述编码磷脂酶D的基因序列如SEQIDNO.2所示。5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体为pET28a(+)，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。6.一种重组磷脂酶D的制备方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，秦雯，吴承晋，华嘉伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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