一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法：将合成的pEGF基因与乳酸乳球菌质粒pNZ8148同时双酶切、回收、连接，转化至大肠杆菌CM1061感受态细胞中，使用氯霉素抗性进行筛选后，经PCR鉴定得出正确的重组质粒后，提取重组质粒并电转至乳酸乳球菌NZ9000中，再经PCR鉴定正确，得到重组乳酸乳酸球pEGF‑pNZ8148‑NZ9000；本发明专利技术对表达的重组猪表皮生长因子进行了纯化，并对重组蛋白进行了Tricine‑SDS‑PAGE鉴定。

A recombinant Lactococcus lactis expressing porcine epidermal growth factor gene and its construction method

The invention discloses a recombinant Lactococcus lactis expressing porcine epidermal growth factor gene and construction methods: the pEGF gene and plasmid from Lactococcus lactis pNZ8148 synthesis and double enzyme digestion, recovery, connection, was transformed into E. coli CM1061 competent cells, the use of chloramphenicol resistance were screened and identified by PCR recombinant plasmid was correct after that, the recombinant plasmid was extracted and transferred to the electric Lactococcus lactis NZ9000, then identified by PCR, to obtain the recombinant lactic acid pNZ8148 ball pEGF NZ9000; the invention of purified growth factor on expression of recombinant porcine epidermis, and the recombinant proteins were Tricine SDS PAGE identification.

【技术实现步骤摘要】
一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法
本专利技术涉及一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法。
技术介绍
表皮生长因子(EGF)是一类重要的生长因子，是类EGF大家族的一个成员。它是由50-60个氨基酸分子组成的肽链，链中含有6个半胱氨酸分子，半胱氨分子间形成稳定的双硫键。使整条肽链成为三个环联部分的活性物质。它是一种广泛存在于人或其它动物体内的小分子多肽，极微量即能强烈刺激细胞生长、抑制衰老基因的出现，延缓表皮细胞衰老。他通过与其受体相结合发挥作用。表皮生长因子通过与细胞表面的受体表皮生长因子受体(EGFR)结合而起作用。与表皮生长因子受体的高亲和力结合，激发受体内在的酪氨酸激酶的活性，从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升，增加糖酵解与蛋白质合成,增加某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达，最终导致DNA合成和细胞增殖。猪EGF蛋白含53个氨基酸残基，相对分子质量6.2KD，主要由唾液腺、乳汁、Paneth细胞、十二指肠的Brunners腺和胰腺等分泌至胃肠道，在消化道中发挥作用，EGF对酸和热非常稳定，对抵抗多种消化酶的消化作用，因此这对其维持结构的稳定和发挥生物学作用具有重要的意义。乳酸乳球菌是人体和畜禽体内的益生菌，能够定殖于肠道，可以很好的维持微生态平衡，分泌多种促生长酶类，促进消化，能够分泌维生素及抗菌肽，对肠道健康与有害微生物的抑制具有重要作用。同时乳酸乳酸菌已在各个领域广泛应用，已证实其为安全级微生物，无致病性。
技术实现思路
本专利技术其目的就在于提供一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法，对表达的重组猪表皮生长因子进行了纯化，并对重组蛋白进行了Tricine-SDS-PAGE鉴定。为实现上述目的而采取的技术方案是，一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌，所述的重组乳酸乳球菌为pEGF-pNZ8148-NZ9000。一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，包括以下步骤：（1）用限制性内切酶分别对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切；（2）使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收，再经T4DNA连接酶对酶切产物进行连接反应后转化至大肠杆菌MC1061感受态细胞中，使用氯霉素抗性进行筛选后，经酶切鉴定、PCR鉴定得出正确的重组质粒；（3）提取重组质粒并电转至乳酸乳球菌NZ9000中，再经PCR鉴定正确，得到重组乳酸乳酸球菌株pEGF-pNZ8148-NZ9000。有益效果与现有技术相比本专利技术具有以下优点。本专利技术对表达的重组猪表皮生长因子进行了纯化，并对重组蛋白进行了Tricine-SDS-PAGE鉴定。附图说明以下结合附图对本专利技术作进一步详述。图1为筛选猪表皮生长因子基因与pNZ8148质粒连接的阳性克隆子电泳图（引物pEGF-F和pEGF-R，产物约189bp）；图2为乳酸乳球菌NZ9000表达pEGF蛋白的Tricine-SDS-PAGE图（蛋白大小在6.2KD左右）；图3为pNZ8148质粒图谱。具体实施方式一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌，所述的重组乳酸乳球菌为pEGF-pNZ8148-NZ9000。一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，如图1-3所示，包括以下步骤：（1）用限制性内切酶分别对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切；（2）使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收，再经T4DNA连接酶对酶切产物进行连接反应后转化至大肠杆菌MC1061感受态细胞中，使用氯霉素抗性进行筛选后，经酶切鉴定、PCR鉴定得出正确的重组质粒；（3）提取重组质粒并电转至乳酸乳球菌NZ9000中，再经PCR鉴定正确，得到重组乳酸乳酸球菌株pEGF-pNZ8148-NZ9000。所述的对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切的两种限制性内切酶分别为NcoI、XbaI。所述氯霉素筛选所用的浓度分别为50ug/ml和25ug/ml。实施例1猪表皮生长因子基因合成对猪表皮生长因子氨基酸序列（AF336151）进行分析，去掉上游信号肽序列，得到53氨基酸的成熟肽序列：NSYSECPPSHDGYCLHGGVCMYIEAVDSYACNCVFGYVGERCQHRDLKWWELR通过乳酸乳球菌的密码子偏好性对该序列进行密码子优化，在序列上游添加6个组氨酸的核苷酸，便于重组蛋白的验证及纯化，并在其上下游分别设计NcoI和XbaI两个限制性内切酶位点及保护性碱基，对优化好的序列进行人工合成：CATGCCATGGCATCATCATCATCATCATAATAGCTATAGCGAATGTCCACCATCTCATGATGGTTATTGTTTACATGGTGGAGTTTGTATGTATATTGAAGCAGTTGATTCATATGCTTGTAATTGTGTTTTTGGATATGTGGGAGAAAGATGTCAACATAGAGATTTAAAATGGTGGGAATTACGTTCTAGAGC实施例2构建重组质粒pEGF-pNZ81481、相关培养基的配制LB固体培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%NaCl2,2%琼脂LB液体培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%NaCl22、pEGF基因和pNZ8148质粒的双酶切反应用NcoI和XbaI分别对pEGF基因和pNZ8148质粒双酶切，双酶切反应体系如下：体系体积（ul）NcoI2XbaI2pEGF基因/pNZ8148质粒20BSA110×Mbuffer5ddH2O20总体积50于37℃温箱反应3h后，加入10ul的6×loadingbuffer，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳分别跑胶，使用凝胶回收试剂盒回收pEGF基因和pNZ8148质粒的双酶切片段。3、pEGF基因和pNZ8148质粒的连接反应回收好的pEGF基因和pNZ8148质粒用T4DNA连接酶连接。T4DNA连接酶连接体系：体系体积（ul）pEGF基因8pNZ8148质粒9T4DNA连接酶110×buffer2总体积20将反应体系放入4℃冰箱静置反应18h。4、MC1061大肠杆菌感受态细胞的制备4.1从LB培养基平板上挑取大肠杆菌MC1061单菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；4.2取1ml过夜培养物加至50mLLB液体培养基中,振荡培养2-3h，至OD600≈0.4；4.3用预冷的50mL离心管于4℃离心，2500rpm离心10min，弃上清；4.4用预冷的25mL0.1MCaCl2重悬菌体，冰上静置10min，于4℃离心，2500rpm离心10min，弃上清，回收菌体；4.5用预冷的2.5mL0.1MCaCl2重悬菌体，分装每管100uL，于-80℃冻存备用。5、连接产物转化MC1061大肠杆菌感受态细胞5.1取出-80℃冻存的大肠杆菌MC1061感受态细胞（100ul装），握于手心中20sec快速融化后置于冰上；5.2吸取15uL连接产物轻轻加至大肠杆菌MC1061感受态细胞底部，冰浴30min；5.342℃水浴热击90sec，迅速放置冰上1min；5.4加入预冷的LB培养基900ul，置于37℃摇床培养120rpm缓慢复苏40min；5.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述的重组乳酸乳球菌为pEGF‑pNZ8148‑NZ9000。

【技术特征摘要】
1.一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述的重组乳酸乳球菌为pEGF-pNZ8148-NZ9000。2.根据权利要求1所述的一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用限制性内切酶分别对pNZ8148质粒和pEGF基因进行双酶切；（2）使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对酶切产物进行回收，再经T4DNA连接酶对酶切产物进行连接反应后转化至大肠杆菌MC1061感受态细胞中，使用氯霉素抗性进行筛选后，经酶切鉴定、PCR鉴定得出...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹远东，周志，曾二生，潘烘，汪石粮，
申请(专利权)人：江西嘉博生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36