发酵法生产胍基丁胺制造技术

本发明专利技术公开了一种通过微生物一步发酵生产胍基丁胺的方法，其采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为胍基丁胺，所生产的胍基丁胺可以进一步制成盐比如硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐、乳清酸盐，用作营养补充剂，具有广阔的工业应用前景。上述方法中使用的微生物包括通过基因工程构建的一种谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12601。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体地说，涉及一种通过微生物发酵生产胍基丁胺的方法。
技术介绍
胍基丁胺(Agmatine)又称鲱精胺、胍丁胺、1-(4-氨丁基)胍，是生物体内天然存在的一种生物活性物质，广泛存在于哺乳动物所有的组织器官中，在心血管系统，胃肠道系统，中枢神经系统等行使着多种生理功能。胍基丁胺作为一种维持运动营养的补充剂，其功能上的很多方面要优于精氨酸，可以帮助使用者提高运动过程中的机体耐力，加快运动后的身体恢复，提高全身构成，包括提高肌肉量和减少肥胖油脂，因而广泛应用于医药和保健品市场。胍基丁胺还有多种药理学活性比如降血糖、降血压、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制细胞增生等，近年来还发现，胍基丁胺在防治癌症方面也具有独特的功效；其对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的拮抗作用较强而持久，具有对动物吗啡依赖性的戒断作用，是一种极具开发价值的戒毒类药物。另外，可用于与不同的脂肪酸反应制备酰基胍丁胺，酰基胍丁胺具有良好的表面活性，可用于洗发精等洗漱用品中。胍基丁胺的工业化制备有化学法和生物酶催化法两类，化学法中一种方案是以1,4-丁二胺为原料，经过单胺基保护，还原、脱保护、成盐等一系列反应最终制得胍基丁胺，另一种方案以1,4-二溴丁烷与邻苯二甲酰亚胺钾为原料，经取代、胺解和胍基化等反应制得胍基丁胺，总收率为33.9％。生物酶催化法是以L-精氨酸为原料，利用精氨酸脱羧酶一步催化制得胍基丁胺。然而目前工业中所用的都为化学法生产，化学法的路线步骤多、收率低、污染严重。目前，人们普遍认为天然或生物来源的化合物更安全，对于药品、食品、化妆品成分的来源越来越追求“天然化”。出于市场推广目的，药品、食品、化妆品生产商都更乐意使用生物来源的产品来替代化学方法合成出来的相同物质。胍基丁胺作为广泛使用的天然化合物，寻找一种生物方法替代化学方法来生产已成为一种研究热点。
技术实现思路
为了实现生物方法来生产“安全无毒”的胍基丁胺，专利技术人对于微生物一步发酵法进行了探索，选择无致病性的微生物作为宿主，利用基因工程技术进行改造，通过增强与胍基丁胺产生相关的基因的表达，弱化分支代谢途径，筛选出高产胍基丁胺的生产菌株。这几种胍基丁胺生产菌在发酵过程中能有效地积累胍基丁胺，具有广阔的工业化应用前景。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种生产胍基丁胺的方法。本专利技术的第二个目的在于提供一种食品级的胍基丁胺。本专利技术的第三个目的在于提供一种胍基丁胺生产菌。本专利技术包括如下技术方案：一种生产胍基丁胺的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为胍基丁胺，所述微生物中产生的胍基丁胺被排出到发酵液中，从发酵液中回收胍基丁胺，所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：将葡萄糖转化为谷氨酸；将谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸；将N-乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛；将N-乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸；将N-乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸；将鸟氨酸转化为瓜氨酸；将瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸；将精氨基琥珀酸转化为精氨酸；将精氨酸转化为胍基丁胺。优选地，所述微生物过表达一种以上选自下组的酶：N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthase)、N-乙酰鸟氨酸-δ-转氨酶(N-acetylornithine-δ-aminothransferase)、N-乙酰鸟氨酸酶(N-acetylornithinase)、鸟氨酸甲氨酰转移酶(ornithine carbamoyl thransferase)、精氨酸琥珀酸酶(arginosuccinate synthetase)、左旋精氨酸脱羧酶L-ADC(L-Arginine decarboxylase，EC:4.1.1.19)。更优选所述微生物过表达左旋精氨酸脱羧酶。在优选的实施方式中，所述微生物是谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12601。发酵过程中，对于不同的微生物，可采用不同的培养基，其中所述碳源可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油。发酵培养基中的氮源可以选自有机氮源 和无机氮源，所述有机氮源选自玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液、酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨和尿素；所述无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、或氨水。根据本专利技术的优选实施例，当微生物采用谷氨酸棒杆菌时，发酵培养基组成如下：葡萄糖75g/L、玉米浆25-30g/L、(NH4)2SO4 20g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、尿素1.0g/L、组氨酸30mg/L、糖蜜25g/L、生物素100μg/L，消泡剂0.2g/L。优选地，当发酵过程中进行补料，即采取分批补料培养方式时，所使用的补料培养基组成如下：硫酸铵500g/L、葡萄糖650g/L。胍基丁胺在水中易溶解。可选地，可以进一步通过在水中重结晶方法纯化胍基丁胺。为白色粉末，纯度达到99％以上、优选99.5％以上，更优选99.7％以上。胍基丁胺是一种碱性物质，可以与酸形成盐。可选地，本专利技术的胍基丁胺呈盐的形式，比如是硫酸盐(Agmatine sulfate)、盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐、乳清酸盐；优选硫酸盐。通过本专利技术的方法制备的胍基丁胺及其盐，不含细菌内毒素，也不包含有毒害性的化学物质，因此可以保障其食品安全性。另外，由于不含化学残留物或化学反应杂质，本专利技术的胍基丁胺不含化学异味比如苦味，可以直接用于制作药品、保健品或化妆品。并且将其命名为“AgmaPure”和“AgmaGo”。一种谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12601。本专利技术所构建的胍基丁胺生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中胍基丁胺的有效积累，得到食品级的胍基丁胺，因而具有广阔的工业应用前景。本专利技术构建的胍基丁胺高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacterium glutamicum，中文名称是谷氨酸棒杆菌或谷氨酸棒状杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2016年6月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12601。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说 明外，皆指质量百分含量。本专利技术的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。在本文中，对于本专利技术，术语“胍基丁胺基因工程生产菌”、“胍基丁胺生产菌”、“胍基丁胺基因工程菌”表示相同的意义，都是指专利技术人构建的用于发酵生产胍基丁胺的微生物。在本专利技术中，术语“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒状杆菌”、“菌株CGMCC No.12601”、“谷氨酸棒(状)杆菌HR055”表示相同的意义，都是指专利技术人构建的用于发酵生产胍基丁胺的菌株。为了满足消费者以及药品、食品和化妆品生产商对于胍基丁胺“天然化”或“生物化”来源的追求，专利技术人研究了用微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产胍基丁胺的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为胍基丁胺，所述微生物中产生的胍基丁胺被排出到发酵液中，从发酵液中回收胍基丁胺，所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：将葡萄糖转化为谷氨酸；将谷氨酸转化为N‑乙酰谷氨酸；将N‑乙酰谷氨酸转化为N‑乙酰谷氨酸半醛；将N‑乙酰谷氨酸半醛转化为N‑乙酰鸟氨酸；将N‑乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸；将鸟氨酸转化为瓜氨酸；将瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸；将精氨基琥珀酸转化为精氨酸；将精氨酸转化为胍基丁胺。

【技术特征摘要】
1.一种生产胍基丁胺的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为胍基丁胺，所述微生物中产生的胍基丁胺被排出到发酵液中，从发酵液中回收胍基丁胺，所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：将葡萄糖转化为谷氨酸；将谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸；将N-乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛；将N-乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸；将N-乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸；将鸟氨酸转化为瓜氨酸；将瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸；将精氨基琥珀酸转化为精氨酸；将精氨酸转化为胍基丁胺。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物过表达一种以上选自下组的酶：N-乙酰谷氨酸合成酶、N-乙酰鸟氨酸-δ-转氨酶、N-乙酰鸟氨酸酶、鸟氨酸甲氨酰转移酶、精氨酸琥珀酸酶、左旋精氨酸脱羧酶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物过表达精氨酸琥珀酸酶和左旋精氨酸脱羧酶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41