表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种大肠杆菌工程菌，本发明专利技术还提供一种大肠杆菌工程菌的制备方法，步骤是克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，双酶切上述cDNA，将酶切片段连接pCold-TF载体,鉴定得到的质粒pCold-TF-LiP是否阳性表达，将阳性质粒pCold-TF-LiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，本发明专利技术还提供大肠杆菌工程菌的应用，方法是将大肠杆菌工程菌接种于液体培养基，液体培养基中加入氨苄青霉素，培养至OD600为0.58～0.62，加入蛋白诱导剂IPTG，诱导重组蛋白表达，本发明专利技术的大肠杆菌工程菌表达量高，活性极强，酶活为3528U/L。

Escherichia coli engineering bacteria expressing lignin peroxidase, preparation method and application thereof

The invention relates to a recombinant Escherichia coli, the invention also provides a preparation method of Escherichia coli, cloning steps phanerochaetechrysosporium lignin peroxidase gene cDNA, double enzyme digestion of the cDNA, the fragment connected to pCold-TF vector plasmid identified by pCold-TF-LiP is positive the expression of the positive plasmid pCold-TF-LiP into E.coli BL21 competent cells, obtain the Escherichia coli expression of lignin peroxidase, the invention also provides the application of Escherichia coli, is Escherichia coli inoculated in the liquid culture medium with ampicillin medium in liquid culture, culture to OD600 from 0.58 to 0.62, adding agent IPTG induced protein, induce the expression of recombinant protein of Escherichia coli, the invention of high expression, strong activity, activity was 352. 8U/L.

【技术实现步骤摘要】
表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用
本专利技术涉及一种大肠杆菌工程菌，具体是一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用。
技术介绍
木质素是地球上已知的第二大量的生物高聚物，结构非常复杂，不容易降解(Martinez,A.T.，et al.2005.Biodegradation of lignoceIIulosics:microbial，chemical，and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin.〃Int Microbiol8:195-204)。由于缺乏适当的处理，许多木质素变成了废物，引发了各种各样的环境问题。伴随着能源的日益紧张，已有国内外研究人员试图通过转变木质素来生产乙醇作为替代能源并取得一定进展。木质纤维素也被用于制造纸的原材料、培养食用菌和动物饲料(Sanchez, C.2009.^Lignocellulosic residues:biodegradation and bioconversion byfung1.Biotechnol Adv 27:185-194)。我国每年的木质素废物产量巨大，堆积如山，随之衍生的木质素生物转变和资源化利用具有广阔的应用前景。虽然木质素的用途多样，然而由于缺乏强有力的木质素资源化转变技术，极大地制约了它的资源化利用。截至目前，木质素的利用率仍旧是非常低的。分解木质素的方法是多样的。特别地，微生物降解木质素是当前公认的既经济又友好的方式。微生物通过分泌木质素降解酶，能有效地降解木质素。木质素过氧化物酶就是一种重要的木质素降解酶，由包含亚铁血红素的糖蛋白构成(Choinowski, T., et al.1999.^The crystal structure of lignin peroxidase at 1.70A resolution reveals a hydroxy group on the cbeta of tryptophan 171:a novelradical site formed during the redox cycle.J Mol Biol 286:809-827)，主要由真菌等微生物分泌，种类繁多，包括 Ligninase H2、Ligninase H8、Ligninase A、LigninaseB、Ligninase C、Ligninase LG2、Ligninase LG3、Ligninase LG5、Ligninase LG6、Ligninperoxidase lipj、 Lignin peroxidase isoform A、 Lignin peroxidase isoform lipB、Lignin peroxidase isoform lipD、Lignin peroxidase isoform lipE、Lignin peroxidaseisoform IipG 等(http:// www.uniprot.0rg/)。自然界中许多微生物例如白腐真菌可以分泌木质素过氧化物酶。因此，白腐真菌已普遍应用于木质素的生物降解。例如黄孢原毛平革菌(一种白腐真菌)分泌的木质素过氧化物酶具有较强的木质素降解能力。尽管白腐真菌依赖其强大的木质素降解能力而被普遍应用于木质素降解研究中，但是当同细菌相比较，其繁殖速度一般低于细菌，致使其在实际的推广使用中受到了一定的限制。此外，白腐真菌分泌的木质素过氧化物酶的数量是有限的，难于大规模的应用于木质素废物的生物降解和工业生产中的纸浆漂白，仅仅依赖现存的微生物分泌的少量的木质素过氧化物酶进行降解是不现实的。
技术实现思路
本专利技术的目的是将细菌快速的繁殖能力和白腐真菌木质素过氧化物酶强大的木质素降解能力结合起来，通过基因克隆和重组的方法得到一种能表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，另外提供大肠杆菌工程菌的制备方法和应用。本专利技术的能表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌，构建其所需的步骤如下: (O克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的CDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为SEQ ID NO:01 ;通过木质素过氧化物酶的序列构建其基因的cDNA序列，适当调整，得到所述基因的cDNA序列为SEQ ID N0:02。(2)用如I和通ο I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4 DNA连接酶连接pCold-TF载体，得到重组原核表达质粒pCold-TF-Zi凡(3)鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-Zi产是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCoId-TF-Zi凡(4)将阳性重组质粒pCoId-TF-ZiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^是否阳性表达的方法为: (一)热击法将重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^导入至DH5 α感受态细胞中。(二)菌液PCR扩增鉴定，得到阳性克隆的DH5 α ;所述PCR扩增所使用的正向引物为 5，- aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，序列为 SEQ ID N0:03,反向引物为 5’-aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3，，序列为 SEQ ID N0:04。 (三)碱裂解法对上述阳性克隆的DH5α提取重组质粒。(四)重组质粒进行I和通OI双酶切鉴定，对目的片段进行测序，测序正确的重组质粒为阳性重组质粒pCoId-TF-Zi凡本专利技术还提供一种大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用，步骤是: 将表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌接种于LB液体培养基，LB液体培养基中加入氨苄青霉素80~120mg/L, 35~37°C，180~220 rpm,培养至OD600为0.58-0.62，加入蛋白诱导剂IPTG，16°C，200rpm，诱导重组蛋白表达12~16h。所述LB液体培养基的配方为:蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。将诱导表达后的大肠杆菌工程菌装入离心管中，离心，弃上清液，加入缓冲液重悬，超声破碎，加入镍柱，进行纯化。本专利技术的有益效果是: 1.本专利技术合成的木质素过氧化物酶来源于黄孢原毛平革菌，白腐真菌属于真菌门担子菌纲，形状为丝状，黄孢原毛平革菌是白腐真菌中的典型代表，具有较强的木质素降解能力。2.本专利技术所使用的大肠杆菌BL21具有很快的繁殖能力，保证了重组得到的大肠杆菌工程菌能在很短的时间里生产一定数量的木质素过氧化物酶，能用于木质素固体废物的降解和纸浆工业的漂白。3.本专利技术所获得的一种能表达合成的木质素过氧化物酶基因的大肠杆菌工程菌体积小易培养，适合大规模工业化生产木质素过氧化物酶。4.本专利技术选取的Ligninase LG3的全长蛋白质序列是已知的,而其它的木质素过氧化物酶基因很多是片段的，克隆片段或非全长基因序列很难获得基因的全部功能，可能导致其构建的工程菌表达的木质素过氧化物酶没有活性。5.本专利技术选取Ligninase LG3相较于其它木质素过氧化酶蛋白质序列长度适中且蛋白质全长序列已知，便于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，其特征是，制备方法是:（1）克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase?LG3，蛋白序列为SEQ?ID?NO:01；（2）用BamH?I和Xho?I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4?DNA连接酶连接pCold?TF载体,得到重组原核表达质粒pCold?TF?LiP；（3）鉴定重组原核表达质粒pCold?TF?LiP是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold?TF?LiP；（4）将阳性重组质粒pCold?TF?LiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，其特征是，制备方法是: (O克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的CDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为 SEQ ID N0:01 ； (2)用BeuM I和通ο I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4DNA连接酶连接pCold-TF载体，得到重组原核表达质粒pCold-TF-Zi产； (3 )鉴定重组原核表达质粒pCo I d-TF-Zi^是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold-TF-Zi/7 ； (4)将阳性重组质粒pCoId-TF-ZiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。2.一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是， (O克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为 SEQ ID N0:01 ； (2)用及I和通ο I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4DNA连接酶连接pCold-TF载体，得到重组原核表达质粒pCold-TF-Zi产； (3 )鉴定重组原核表达质粒pCo I d-TF-Zi^是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold-TF-Zi/7 ； (4)将阳性重组质粒pCoId-TF-ZiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。3.如权利要求2所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，所述cDNA序列为SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明，晏铭，曾光明，杜长青，张嘉超，鲁伦慧，朱艺，赖萃，许飘，武海鹏，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：