一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于转纤维素酶基因的工程菌技术领域。该所述基因工程菌共表达经过密码子偏好性优化后的污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)内切‑1,4‑β‑D‑葡聚糖苷酶基因和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)外切‑1,4‑β‑D‑葡聚糖苷酶基因。本发明专利技术基因工程菌相比于野生型枯草芽胞杆菌菌株，降解纤维素的速度得到了显著提高，发酵96h对干草中纤维素的降解率由42.30％提高至91.45％，提高了49.15％。可以用于饲料添加剂以降解纤维素提高饲料利用率。

Bacillus subtilis genetic engineering strain with cellulase gene and its construction method and Application

The invention discloses a Bacillus subtilis genetic engineering strain with cellulase gene and its construction method and application, belonging to the technical field of engineering bacteria for cellulase gene transformation. The co expression of gene engineering bacteria after dichomitus squalens codon optimized (Dichomitus squalens) 1,4 D endo beta glucanase gene and Phanerochaete Chrysosporium (Phanerochaete Chrysosporium) cut 1,4 D beta glucanase for. Compared with the wild type bacillus subtilis strain, the gene engineering bacteria of the present invention has significantly improved the rate of cellulose degradation, and the degradation rate of cellulose in the hay by fermentation 96h increases from 42.30% to 91.45%, and increases by 49.15%. It can be used as feed additive to degrade cellulose and improve feed utilization.

【技术实现步骤摘要】
一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于转纤维素酶基因的工程菌

技术介绍
农作物副产物秸秆、其它草秆富含纤维素、半纤维素和木质素。其中纤维素的单体是葡萄糖，降解含有纤维素的农作物副产品，对农业生产具有重要的意义。天然降解含纤维素的微生物主要有放线菌如白腐真菌。枯草芽胞杆菌是畜禽生产使用的主要益生菌之一，用于发酵秸秆等粗饲料或豆粕、玉米、麦麸等，其代谢产物富含氨基酸、抗菌肽和营养因子，能显著提高饲料的利用率和畜禽的生产性能。枯草芽胞杆菌本身含有降解纤维素的酶系，对半纤维素也有一定的降解效果，但对木质素没有作用。提高枯草芽胞杆菌降解纤维素的能力，将显著提高枯草芽胞杆菌发酵秸秆等粗饲料或豆粕、玉米、麦麸等的效果，降低成本，提高含有纤维素的农作物副产品的利用率。转基因益生菌的研究为益生菌的更好应用开辟了新的技术途径。随着人类基因组后计划的实施，枯草芽胞杆菌、白腐真菌、多孔菌科真菌等的基因组已经完成测序工作。目前市场上的益生菌添加到农作物副产物的饲料中，主要利用的益生菌对病原菌的拮抗作用、营养素的提供、机体免疫功能的提高、肠道内环境的净化等功能，但没有主要针对纤维素消化和降解的益生菌的应用。而目前针对纤维素的消化和降解的饲料添加剂主要是酶制剂，但在粗放的工业条件下(如高温、高压、重金属离子、氧化剂和极端pH等)，天然酶常会遭到破坏，使酶的生产和使用受到极大限制。目前工业上直接利用酶制剂时还存在一些缺点，如稳定性差、使用率低、不能在有机溶剂中使用及寿命不长等，造成了使用酶的成本升高。
技术实现思路
为解决目前农作物副产品中纤维素的降解、利用率低的问题，本专利技术提供了一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌，该基因工程菌共表达经过密码子偏好性优化后的污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因和黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因；所述经过密码子偏好性优化后的克隆污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述经过密码子偏好性优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述经过密码子偏好性优化后的污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列是通过利用RareCodonCalculator对NCBIGeneBank号为XM_018217264的序列进行稀有密码子分析，结合CodonAdaptionTool分析工具进行密码子偏好性优化获得的。进一步地，所述经过密码子偏好性优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列是通过利用RareCodonCalculator(RaCC)(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对NCBIGeneBank号为XP_007368554的序列进行稀有密码子分析，结合CodonAdaptionTool分析工具进行密码子偏好性优化获得的。本专利技术还提供了一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：1)密码子偏好性优化：利用RareCodonCalculator对NCBIGeneBank号为XM_018217264、XP_007368554的序列进行稀有密码子分析，结合CodonAdaptionTool分析工具分别进行密码子偏好性优化，获得优化后的对污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1所示，优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；2)枯草芽胞杆菌重组表达载体的构建：分别在如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的两端连接BamHI和XbaI酶切位点，利用BamHI和XbaI酶切位点将上述两个基因分别克隆到载体pHT43上，获得两个重组表达载体，分别命名为“pHT43-endo”和“pHT43-exo”，并进行测序验证；3)共转化和筛选：将步骤2)获得的重组表达载体pHT43-endo和pHT43-exo共转化入枯草芽胞杆菌，获得含有pHT43-endo和pHT43-exo的重组枯草芽孢杆菌，然后提取上述重组枯草芽胞杆菌菌落DNA，通过二重PCR反应扩增内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因和外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因，筛选获得两个基因共转化的重组菌株，然后进行传代培养。进一步地，所述步骤3)所述传代培养为传代20代。以获得能够稳定表达和传代的基因工程菌。进一步地，步骤3)所述二重PCR反应中优化后的对污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的引物对序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的引物对序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。进一步地，步骤3)所述二重PCR反应的扩增体系为：100ng模板，5μL10×reactionBuffer，1.2μL10μM内切酶引物，0.8μL10μM外切酶引物，8μL2.5mMdNTPMixture，1.0μL2.5U/μLTaqDNApolymerase，ddH2O补充至50μL。本专利技术的基因工程菌在饲料添加剂中的应用。本专利技术还提供了一种上述基因工程菌在降解纤维素中的应用。进一步地，所述应用是将上述基因工程菌置于含有纤维素的发酵培养基中发酵培养；所述含有纤维素的发酵培养基是通过在MRS液态培养基中添加1％(质量)的干草获得的。进一步地，所述发酵培养的条件为37℃，120r/min，摇床培养。进一步地，所述干草是烘干后粉碎至100目。本专利技术所述干草是指青草或栽培青绿饲料在结实前的生长植株地上部分经一定干燥方法制成的粗饲料。干草可以看成是青饲料的加工产品，是为了保存青饲料的营养价值而制成的贮藏产品。干草饲料是主要提供畜禽类尤其是反刍类动物消化所必需的粗纤维的必备饲料。常见的干草饲料如牧草之王紫花苜蓿、大燕麦干草、大麦干草等。本专利技术获得的稳定表达两种纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌需稳定传代20代。本专利技术利用克隆污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因(endo-1,4-β-D-glucanase)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因(exo-1,4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌共表达经过密码子偏好性优化后的污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)内切‑1,4‑β‑D‑葡聚糖苷酶基因和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)外切‑1,4‑β‑D‑葡聚糖苷酶基因；所述经过密码子偏好性优化后的克隆污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)内切‑1,4‑β‑D‑葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过密码子偏好性优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)外切‑1,4‑β‑D‑葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌共表达经过密码子偏好性优化后的污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因和黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因；所述经过密码子偏好性优化后的克隆污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述经过密码子偏好性优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述经过密码子偏好性优化后的污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列是通过利用RareCodonCalculator对NCBIGeneBank号为XM_018217264的序列进行稀有密码子分析，结合CodonAdaptionTool分析工具进行密码子偏好性优化获得的。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述经过密码子偏好性优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)外切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列是通过利用RareCodonCalculator对NCBIGeneBank号为XP_007368554的序列进行稀有密码子分析，结合CodonAdaptionTool分析工具进行密码子偏好性优化获得的。4.一种权利要求1所述的转纤维素酶基因的枯草芽胞杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)密码子偏好性优化：利用RareCodonCalculator对NCBIGeneBank号为XM_018217264、XP_007368554的序列进行稀有密码子分析，结合CodonAdaptionTool分析工具分别进行密码子偏好性优化，获得优化后的对污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)内切-1,4-β-D-葡聚糖苷酶基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1所示，优化后的黄孢原毛平革菌(Phanerochae...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明辉，甄贞，孙喆，温学鹏，高学军，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23