一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法技术

一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术将质粒pET20b(+)的信号肽PelB与长野芽孢杆菌（Bacillusnaganoensis）CCTCC?NO：M2012388普鲁兰酶基因pul连接，并共同插入表达载体pET28a(+)中，构建带有信号肽和目的基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-PelB-pul。将自诱导培养和添加甘氨酸调控细胞透性的策略用于胞外普鲁兰酶的发酵生产，采用乳糖浓度10g/L的自诱导培养基，于37℃、200rpm震荡培养约2h后，添加终浓度6g/L的甘氨酸并转入20℃下培养70h，胞外普鲁兰酶酶活达505U/mL，比野生菌出发菌株的酶活力提高1260倍。本发明专利技术的应用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
—种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法
，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的

技术介绍
普鲁兰酶(pullulanase，EC. 3. 2.1. 41)是一类可以特异性水解普鲁兰、支链淀粉及其极限糊精中的α-1，6_糖苷键的脱支酶。在淀粉糖化过程中，普鲁兰酶与糖化酶共同作用，普鲁兰酶切割支链淀粉分支点，糖化酶只需切割线性的低聚糖，即可显著地提高淀粉的水解效率。使用普鲁兰酶不仅可降低糖化酶用量，还可使DE值提高到97%以上，提高水解产物葡萄糖或麦芽糖的质量和纯度。目前已发现多种产普鲁兰酶的微生物，但大部分都无法应用于工业生产，主要原因有(I)酶的耐热耐酸性差，淀粉的糖化过程在55°c -60°c、pH 4. 5-5. O的范围内进行， 而大多数种类的普鲁兰酶在此范围内活性很低；(2)酶活水平低，很多普鲁兰酶产生菌胞外分泌普鲁兰酶的能力不强，分泌的普鲁兰酶又容易遭到蛋白酶的降解，因此难以进行工业化生产。目前，普鲁兰酶的工业化生产菌株极少，只有诺维信公司和杰能科公司有能力工业化生产并销售此酶。诺维信公司的普鲁兰酶产品占领了中国乃至世界95%以上的市场份额，其价格相当昂贵。我国关本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长野芽孢杆菌（Bacillus?naganoensis）LBMAE?1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC?NO：M?2012388；来源于CCTCC?NO：M?2012388菌株的普鲁兰酶基因pul，其核苷酸序列为SEQ?ID?NO:?1，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:?2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：聂尧，徐岩，严伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：