降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽制造技术

降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，它涉及一种融合多肽。它为了得到一种既含有降钙素又含有降钙素基因相关肽的产品，而提供了一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１所示；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽Ｃ端酰胺化。经实验验证本发明专利技术降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽保留了降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素各自的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种融合多肽。
技术介绍
降钙素(calcitonin， CT)可直接抑制破骨细胞(osteoclasts, OC)增殖，阻 止骨溶解，促进骨形成，并能迅速减轻因骨质疏松而引起的腰锥病疼痛或发病， 是治疗骨质疏松症的首选药物之一。它还可以有效调节骨钙与血钙之间的平 衡，并有镇痛作用；对治疗高血钙症、变形性骨炎、甲状腺机能亢进以及各种 原因引起的骨骼疼痛(如类风湿、肿瘤)等有非常明显的效果，在骨痛病的治 疗中，降钙素的镇痛效果可达吗啡的30 50倍。由于降钙素能抑制胃酸分泌， 它可用于治疗急性胃溃疡；由于降钙素能抑制胰腺激素分泌及抑制酶的释放， 它可用于治疗急性胰腺炎；降钙素对甲状旁腺机能亢进也有治疗作用。降钙素 在慢性多关节炎及心血管疾病的治疗方面也有一定的潜力。鲑鱼降转素 (salmon calcitonin, sCT)是天然降钙素中活性最高的一种，其活性约是人降 钙素的40倍，与人降钙素具有同源性。细胞实验证明鲑鱼降钙素作用在人降 钙素受体上，所产生的第二信使cAMP的量远远大于人降韩素，因此其使用量 占临床用降钙素的近50%。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是调节心血管 活动的重要神经递质之一，是迄今所知的人体最强的舒血管物质。降钙素基因 相关肽扩冠状动脉作用比硝酸甘油、硝普钠强240倍，它是由辣椒素敏感的感 觉神经末梢释放的一种生物活性多肽，广泛分布于神经及心血管系统。在心血 管系统中，降钙素基因相关肽生物活性具有多样性，如强大的舒血管作用、抑 制平滑肌细胞增殖和内皮细胞凋亡，也能促进细胞分化增殖，参与血管新生。 CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质(substance P， SP)、心钠素和去甲 肾上腺素(norepinephrine, NE);比乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)、 5-羟色 胺(5-hydroxytryptamine， 5-HT)等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100 倍。CGRP血管舒张反应呈现不同程度的剂效——依赖性，即适当加大CGRP的注入剂量时反应增强，浓度低则效应缓慢，但持续时间长。Shen等(ShenYT， Pittman TJ， Buie PS. Functional role of alpha-calcitonin gene-related peptide in the regulation of the cardiovascular system. Pharmacol Exp Ther， 2001, 298(3):551-558.)认为尽管外源性的a-CGRP可以引起不同部位血管床的舒张， 但在正常状态下的内源性a-CGRP对血管调节并不起重要作用。经反复实验验 证降钙素基因相关肽能够抑制血管平滑肌细胞增殖、保护内皮细胞和抑制血管 新生，防治高血压，防止充血性心力衰竭，防治心绞痛，防治心肌梗死和治疗 休克。而且具有在脊髓水平调制痛觉的功能，可调节破骨细胞骨吸收和促进成 骨细胞分裂。目前市场上只有降钙素产品，而降钙素基因相关肽只停留在实验室研究阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了得到一种既含有降钙素又含有降钙素基因相关肽的 产品，而提供了一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如SEQIDNO: 1 所示；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。经实验验证本专利技术降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽保留了降转 素基因相关肽和鲑鱼降钙素各自的酶活性；而且偶联反应产生还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸(NADH)的速度是同时加入两种单一 (降转素基因相关肽和鲑 鱼降钙素)多肽的反应体系反应速度的两倍以上，同时过渡态时间(transient time)大大縮短，縮短至原过渡态时间的1/4左右。本专利技术为了提高msCT生物活性依据msCT生物活性对构象依存性的现象 从而对其氨基酸残基进行了改造，将msCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸、第 16位的亮氨酸用丙氨酸置换、再删除22位的酪氨酸(msCT)， msCT的生物活性由4500 IU/mg提高到8600 IU/mg。本专利技术降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化可提高降l 素的活性约30倍(C端酰胺化的本专利技术降钙素基因相关肽与鲑鱼降^素融合 多肽生物学活性为"OO IU/mg， C端非酰胺化的降钙素基因相关肽与鲑鱼降转 素融合多肽生物学活性为100-200 IU/mg)。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方 式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的 氨基酸序列如下AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGly ValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPhe^lylly:CysSerAsnLeuSer ThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGluAlaHisLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySe rGlyThrPro;且降拷素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因由南京基天有限责 任公司合成，融合多肽系本实验室构建菌株进行转入番茄后经亲和层析纯化获 得。.本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因中有一段被称为"亲 和手柄"(affinity handle)的编码序列相连接，这段"亲和手柄"可以与亲和 层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法 快速而简便地纯化出来，所得到的融合多肽蛋白经化学方法或酶法切割开来之 后，混合产物再上同一亲和柱，充作"亲和手柄"的一段多肽或蛋白以及尚未 被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。因此可得 到较高纯度的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。本实施方式在降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的C端加上一个 Gly为肽酰甘氨酸酰化单氧酶酰胺化提供氨基供体。本实施方式在CGRP和msCT氨基酸序列之间设计一个Kpn I酶切位点(如 氨基酸序列下划线所示)，可用于验证阳性克隆及其它基因操作。对本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽进行动物实验实验1:将骨质疏松模型大鼠随机分成两组(治疗组和模型组)，以正常 大鼠为空白对照组；治疗组按体重0.5pg/kg剂量注射本实施方式降转素基因相 关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行84 天，对大鼠血清酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(ALP)和骨l^素(BGP) 进行检测，并对大鼠进行了骨密度测定。检测结果如表1和表2所示。表1大鼠血清TRAP、 ALP、 BGP测定结果(X±S)<table>table see original document page 6</column></row><table>表2大鼠股骨、胫骨、腰椎密度值(X±S)&本文档来自技高网...

【技术保护点】
降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因表达的多肽，其特征在于降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如下：ＡｌａＣｙｓＡｓｐＴｈｒＡｌａＴｈｒＣｙｓＶａｌＴｈｒＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｌａＧｌｙＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙＧｌｙＶａｌＶａｌＬｙｓＡｓｎＡｓｎＰｈｅＶａｌＰｒｏＴｈｒＡｓｎＶａｌＧｌｙＳｅｒＬｙｓＡｌａＰｈｅＧｌｙＴｈｒＣｙｓＳｅｒＡｓｎＬｅｕＳｅｒＴｈｒＣｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｙＬｙｓＬｅｕＳｅｒＧｌｎＧｌｕＡｌａＨｉｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＴｈｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒＡｓｎＴｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＴｈｒＰｒｏ；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽Ｃ端酰胺化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余琼，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]