生产1,4‑丁二醇的微生物和相关方法技术

本发明专利技术提供非天然存在的包含1,4‑丁二醇(BDO)途径的微生物体，该途径包含编码BDO途径酶的至少一种外源核酸，所述核酸以足以产生BDO的量表达，并且为BDO的表达被进一步优化。本发明专利技术另外提供利用所述微生物体生产BDO的方法。

Microbial production of 1,4 butanediol and related methods

The invention provides a non naturally occurring contains 1,4 butanediol (BDO) microorganisms pathway, at least one of the exogenous nucleic acid pathway involves encoding BDO enzymes, expression of the nucleic acid to produce BDO to enough amount, and the expression of BDO was further optimized. The present invention also provides a method for producing BDO using the microorganism.

【技术实现步骤摘要】
生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法本申请是申请日为2010年06月04日、申请号为201080034821.7、名称为“生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法”的专利技术申请的分案。专利技术背景本申请要求2009年6月4日提交的美国临时申请No.61/184，311的优先权，所述全部内容在此通过引用引入。本专利技术总体上涉及生物体的计算机(insilico)设计和生物体的工程改造，更具体而言，涉及具有1,4-丁二醇生物合成能力的生物体。化合物4-羟基丁酸(4-HB)是4-碳羧酸，其具有作为各种日用品和特种化学品的构造单元的工业潜力。具体而言，4-HB具有充当进入1,4-丁二醇家族化学品的新切入点的潜力，所述1,4-丁二醇家族化学品包括溶剂、树脂、聚合物前体和特种化学品。1,4-丁二醇(BDO)是聚合物中间体和工业溶剂，全球每年销售约30亿磅。BDO目前从石油化学前体、初级乙炔(primarilyacetylene)、马来酸酐和环氧丙烷生产。例如，乙炔与2分子甲醛以Reppe合成反应进行反应(Kroschwitz和Grant，EncyclopediaofChem.Tech.，JohnWileyandSons，Inc.，NewYork(1999))，然后通过催化氢化形成1,4-丁二醇。据估计美国生产的90％的乙炔被消耗用于丁二醇生产。可选地，其可以通过源自丁烷的马来酸酐的酯化和催化氢化形成。在下游，丁二醇可以通过例如氧化进一步被转化成γ-丁内酯--其可以进一步转化成吡咯烷酮和N-甲基-吡咯烷酮，或通过例如氢解进一步被转化成四氢呋喃。这些化合物作为聚合物中间体、溶剂和添加剂具有各种用途以及具有每年约20亿磅的组合销路。期望通过可选的手段开发生产这些化学品的方法，该手段不仅用可再生物代替石油基原料，而且使用较少的能源和资金集约型工艺。能源部已经提议1，4-二酸，以及特别是琥珀酸，作为关键的生物学生产的中间体，用于生产丁二醇家族产物(DOEReport，“TopValue-AddedChemicalsfromBiomass”，2004)。然而，琥珀酸的分离和纯化昂贵并且催化还原成丁二醇要求高温和高压。因此，对有效生产商业数量的1,4-丁二醇和其化学前体的可选方法存在需求。本专利技术满足了这种需求并且还提供相关的优势。专利技术概述本专利技术提供包含1,4-丁二醇(BDO)途径的非天然存在的微生物体，该途径包含编码BDO途径酶的至少一种外源核酸，所述核酸以足以产生BDO的量表达，并且为BDO的表达被进一步优化。本专利技术还提供利用所述微生物体生产BDO的方法。附图简述图1是显示4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇生产的生物化学途径的示意图。前5个步骤对于大肠杆菌是内源性的，而其余步骤可以异源表达。催化生物合成反应的酶是：(1)琥珀酰-CoA合成酶；(2)CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(3)α-酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(7)4-羟基丁酸脱氢酶；(8)α-酮戊二酸脱羧酶；(9)4-羟基丁酰CoA：乙酰-CoA转移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸转丁酰酶；(12)醛脱氢酶；(13)醇脱氢酶。图2是显示在大肠杆菌(E.coli)中高丝氨酸生物合成的示意图。图3显示使用含有表达各种组合的4-HB途径基因质粒的大肠杆菌菌株在葡萄糖基本培养基中生产4-HB。(a)在培养液中的4-HB浓度；(b)在培养液中的琥珀酸浓度；(c)在600nm处测量的培养物OD。条形图组表示24小时、48小时和72小时(如果测量)时间点。沿X轴的编码表示使用的菌株/质粒组合。第一个标记指宿主菌株：1，MG1655lacIQ；2，MG1655ΔgabDlacIQ；3，MG1655ΔgabDΔaldAlacIQ。第二个标记指使用的质粒组合：1，pZE13-0004-0035和pZA33-0036；2，pZE13-0004-0035和pZA33-0010n；3，pZE13-0004-0008和pZA33-0036；4，pZE13-0004-0008和pZA33-0010n；5，对照载体pZE13和pZA33。图4显示在表达来自结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的α-酮戊二酸脱羧酶的大肠杆菌菌株中从葡萄糖生产4-HB。菌株1-3包含pZE13-0032和pZA33-0036。菌株4仅表达空载体pZE13和pZA33。宿主菌株如下：1和4，MG1655lacIQ；2，MG1655ΔgabDlacIQ；3，MG1655ΔgabDΔaldAlacIQ。条形图指在24和48小时时的浓度。图5显示在重组大肠杆菌菌株中从10mM4-HB生产BDO。编号的位置与实验对应，其中MG1655lacIQ包含pZA33-0024，表达来自牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的cat2，以及下列基因在pZE13上表达：1，没有(对照)；2，0002；3，0003；4，0003n；5，0011；6，0013；7，0023；8，0025；9，0008n；10，0035。基因编号在表6中定义。对于每个位置，条形图分别指需氧条件、微需氧条件和厌氧条件。微需氧条件通过密封培养管但不排空它们来建立。图6显示由MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036产生的4-HB和BDO的质谱，MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036生长在补充有4g/L未标记的葡萄糖(a、c、e和g)、均匀标记的13C-葡萄糖(b、d、f和h)的M9基本培养基中。(a)和(b)，衍生BDO的质量116特征碎片，包含2个碳原子；(c)和(d)，衍生BDO的质量177特征碎片，包含1个碳原子；(e)和(f)，衍生4-HB的质量117特征碎片，包含2个碳原子；(g)和(h)，衍生4-HB的质量233特征碎片，包含4个碳原子。图7是生产γ-丁内酯的生物过程的示意性工艺流程图。图(a)图解了伴随分批分离的补料分批发酵，图(b)图解了伴随连续分离的补料分批发酵。图8A和8B显示示例性的1,4-丁二醇(BDO)途径。图8A显示来自琥珀酰-CoA的BDO途径。图8B显示来自α-酮戊二酸的BDO途径。图9A-9C显示示例性的BDO途径。图9A和9B显示来自4-氨基丁酸的途径。图9C显示来自乙酰-CoA至4-氨基丁酸的途径。图10显示示例性的来自α-酮戊二酸的BDO途径。图11显示示例性的来自谷氨酸的BDO途径。图12显示示例性的来自乙酰-CoA的BDO途径。图13显示示例性的来自高丝氨酸的BDO途径。图14显示大肠杆菌琥珀酰-CoA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。图14A显示大肠杆菌sucCD操纵子的核苷酸序列(SEQIDNO：)。图14B(SEQIDNO：)和14C(SEQIDNO：)显示由sucCD操纵子编码的珀酰-CoA合成酶亚单位的氨基酸序列。图15显示牛分枝杆菌α-酮戊二酸脱羧酶的核苷酸和氨基酸序列。图15A显示牛分枝杆菌sucA基因的核苷酸序列(SEQIDNO：)。图15B显示牛分支杆菌α-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列(S本文档来自技高网...

【技术保护点】
非天然存在的微生物体，包括具有1,4‑丁二醇(BDO)途径的微生物体，该途径包括编码在一定条件下以足够量表达而生产BDO的BDO途径酶的至少一种外源核酸，其中所述微生物体经遗传修饰以表达外源的琥珀酰‑辅酶A合成酶；以表达外源的α‑酮戊二酸脱羧酶；以表达外源的琥珀酸半醛脱氢酶和4‑羟基丁酸脱氢酶并且任选地表达4‑羟基丁酰‑辅酶A/乙酰‑辅酶A移转酶；以表达外源的丁酸激酶和磷酸转丁酰酶；以表达外源的4‑羟基丁酰‑辅酶A还原酶；和以表达外源的4‑羟基丁醛还原酶；以表达外源的丙酮酸脱氢酶；以破坏编码需氧的呼吸控制调节系统的基因；以表达外源的NADH不敏感的柠檬酸合成酶；以表达外源的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。

【技术特征摘要】
2009.06.04 US 61/184,3111.非天然存在的微生物体，包括具有1,4-丁二醇(BDO)途径的微生物体，该途径包括编码在一定条件下以足够量表达而生产BDO的BDO途径酶的至少一种外源核酸，其中所述微生物体经遗传修饰以表达外源的琥珀酰-辅酶A合成酶；以表达外源的α-酮戊二酸脱羧酶；以表达外源的琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶并且任选地表达4-羟基丁酰-辅酶A/乙酰-辅酶A移转酶；以表达外源的丁酸激酶和磷酸转丁酰酶；以表达外源的4-羟基丁酰-辅酶A还原酶；和以表达外源的4-羟基丁醛还原酶；以表达外源的丙酮酸脱氢酶；以破坏编码需氧的呼吸控制调节系统的基因；以表达外源的NADH不敏感的柠檬酸合成酶；以表达外源的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。2.具有1,4-丁二醇(BDO)途径的非天然存在的微生物体，其包括以足够量表达而生产BDO的BDO途径酶，其中所述微生物体经遗传修饰，且所述微生物体：(A)包含选自如下的BDO途径：(i)BDO途径，其包含：(a)α-酮戊二酸脱羧酶；α-酮戊二酸脱氢酶和辅酶A-依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶；和或谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶；(b)4-羟基丁酸脱氢酶；(c)4-羟基丁酰-辅酶A/乙酰-辅酶A移转酶；和/或丁酸激酶和磷酸转丁酰酶；(d)4-羟基丁酰-辅酶A还原酶和4-羟基丁醛还原酶；和/或醛/醇脱氢酶；(ii)BDO途径，其包含：(a)α-酮戊二酸脱羧酶；和/或琥珀酰-辅酶A合成酶和辅酶A-依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶；(b)4-羟基丁酸脱氢酶；(c)4-羟基丁酰-辅酶A转移酶；和/或4-羟基丁酸激酶和磷酸转-4-羟基丁酰酶；和(d)醛脱氢酶和醇脱氢酶；和/或醛/醇脱氢酶；(iii)BDO途径，其包含：(a)α-酮戊二酸脱羧酶；谷氨酸脱氢酶；谷氨酸脱羧酶；和去氨基的4-氨基丁酸氧化还原酶或4-氨基丁酸氨基转移酶；和/或α-酮戊二酸脱氢酶和辅酶A-依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶；(b)4-羟基丁酸脱氢酶；和(c)4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；4-羟基丁酰-辅酶A还原酶；和4-羟基丁醛还原酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸化的4-羟基丁醛脱氢酶；和4-羟基丁醛还原酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；和醇形成的4-羟基丁酰-辅酶A还原酶；4-羟基丁酰-辅酶A转移酶或4-羟基丁酰-辅酶A水解酶或4-羟基丁酰-辅酶A连接酶；4-羟基丁酰-辅酶A还原酶；和4-羟基丁醛还原酶；和/或4-羟基丁酰-辅酶A转移酶或4-羟基丁酰-辅酶A水解酶或4-羟基丁酰-辅酶A连接酶；和醇形成的4-羟基丁酰-辅酶A还原酶；(iv)BDO途径，其包含：(a)谷氨酸辅酶A转移酶或谷氨酰基-辅酶A水解酶或谷氨酰基-辅酶A连接酶；谷氨酰基-辅酶A还原酶；和谷氨酸-5-半醛还原酶；谷氨酸辅酶A转移酶或谷氨酰基-辅酶A水解酶或谷氨酰基-辅酶A连接酶；和醇形成的谷氨酰基-辅酶A还原酶；和/或谷氨酸5-激酶；磷酸化的谷氨酸-5-半醛脱氢酶；和谷氨酸-5-半醛还原酶；(b)去氨基的2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶或2-氨基-5-羟基戊酸氨基转移酶；和(c)5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶；和4-羟基丁醛还原酶；脱羧的5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；4-羟基丁酰-辅酶A还原酶；和4-羟基丁醛还原酶；和/或脱羧的5-羟基-2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·J·万殿，A·P·博加德，罗伯特·哈瑟尔贝克，凯瑟琳·J·普若尔巴克斯利，牛巍，约翰·D·特拉威克，哈里·伊姆，M·J·伯克，罗宾·E·奥斯特豪特，孙军，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：美国,US