一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种产β‑胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法，该方法首先优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtY

【技术实现步骤摘要】
一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法
本专利技术属于代谢工程
，具体涉及一种利用代谢工程改造类球红细菌构建产β-胡萝卜素菌株的方法。
技术介绍
β-胡萝卜素广泛存在于胡萝卜、枸杞等绿色蔬菜和黄色、橙色水果中，由于它的不饱和结构，使它具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，能够有效提高机体的免疫功能，目前已被广泛应用于功能食品、医药保健和化妆品等领域，国际市场需求日益扩增。天然β-胡萝卜素主要来源于植物提取和微生物发酵，但植物来源的β-胡萝卜素生产成本因受原材料的限制而居高不下，而化学合成的β-胡萝卜素多为全反式结构、生物活性低且安全性备受质疑。微生物发酵法由于易于大规模可持续生产、环境友好和成本低等特性，且随着现代代谢工程技术的快速发展，利用微生物发酵生产β-胡萝卜素已成为必然趋势。目前，唯一用于工业化生产β-胡萝卜素的菌株是三孢布拉霉(Blakesleatrispora)，但是三孢布拉霉缺乏有效的分子操作技术，且其菌体分为正负菌，代谢调控复杂，其发酵中也存在不少的问题，如发酵工艺较复杂，不稳定，周期长等。类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产β‑胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于：首先优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子，获得opt crtYPa基因，然后用含启动子prrnB的opt crtYPa基因和成团泛菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa基因无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3，再敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6‑磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，最后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶基因dxs，得到产β‑胡萝卜素类球红细菌工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于：首先优化成团泛菌来源的番茄红素环化酶基因crtYPa的密码子，获得optcrtYPa基因，然后用含启动子prrnB的optcrtYPa基因和成团泛菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa基因无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crtI3，再敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，最后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，得到产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌。2.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于：所述optcrtYPa基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于用含启动子prrnB的optcrtYPa基因和crtIPa基因无痕替换crtI3基因的方法为：利用引物opt-crtYPa-F和opt-crtYPa-R，用保真酶PfuPCR扩增含启动子prrnB的optcrtYPa基因；以成团泛菌CGMCC1.2244的基因为模板，利用引物opt-crtIPa-F和opt-crtIPa-R，用保真酶PfuPCR扩增成团泛菌CGMCC1.2244的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crtIPa；利用引物opt-crtIPaYPa-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的含启动子prrnB的optcrtYPa基因与crtIPa基因，得到optcrtIPaYPa基因；以类球红细菌ATH2.4.1的基因为模板，利用引物opt-crtIPaYPa-up-F和opt-crtIPaYPa-up-R，用保真酶PfuPCR扩增crtI3基因的上游同源臂，利用引物opt-crtIPaYPa-down-F和opt-crtIPaYPa-down-R，用保真酶PfuPCR扩增crtI3基因的下游同源臂；利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的上游同源臂与optcrtIPaYPa基因，再利用引物opt-crtIPaYPa-up-F与opt-crtIPaYPa-down-R，用高保真酶KOD-Plus通过重叠延伸PCR连接扩增的crtI3基因的下游同源臂，实现crtI3基因的上游同源臂-optcrtIPaYPa基因-crtI3基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△crtI3::optcrtIPaYPa片段；将△crtI3::optcrtIPaYPa片段插入到pK18mobsacB质粒的EcoRⅠ和XbaI双酶切位点，获得质粒pK18-△crtI3::optcrtIPaYPa，该质粒热激转化进入S17-1感受态，得到供体菌株S17-1Com△crtI3::optcrtIPaYPa，以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合，得到菌株RC1；上述各引物序列如下：opt-crtYPa-F：CAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGGCopt-crtYPa-R：TGTAGTTCTATTCATTCACTGCATCGCCTGCTGopt-crtIPa-F：AGGCGATGCAGTGAATGAATAGAACTopt-crtIPa-R：TCAAGCCAGATCCTCCAGCAopt-crtIPaYPa-F：AGTTCGCGCCCAACGAAAAACGCCAAGATTTCTTGGopt-crtIPaYPa-R：CAGAGGCAATCATTCAAGCCAGATCCTCCAGCATopt-crtIPaYPa-up-F：CCGGAATTCCTCTCGTCGGCCATCTTGopt-crtIPaYPa-up-R：GTTTTTCGTTGGGCGCGAACTCCTGCAopt-crtIPaYPa-down-F：GGATCTGGCTTGAATGATTGCCTCTGCCGATCTopt-crtIPaYPa-down-R：CTAGTCTAGACGCCCGAGAAACTGTCGTAG。4.根据权利要求3所述的产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌的构建方法，其特征在于敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtC的方法为：以类球红细菌ATH2.4.1的基因为模板，利用引物crtC-up-F和crtC-up-R...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟永宏，强珊，苏安平，陈芝，李颖，
申请(专利权)人：西安海斯夫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61