包含产能发酵途径的基因工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一种包含产能发酵途径的基因工程菌和与其有关的方法。具体来说，本发明专利技术提供一种细菌，其包含磷酸丁酰转移酶(Ptb)和丁酸激酶(Buk)(Ptb‑Buk)，所述Ptb‑Buk作用于非天然底物，产生各种产物和中间体。在某些实施例中，本发明专利技术涉及将Ptb‑Buk引入能够从气态底物产生产物的C1固定微生物中。

GENE ENGINEERING BACTERIA CONTAINING PRODUCTIVE FERMENTATION PATHWAYS

The invention relates to a genetically engineered bacterium comprising a fermentation pathway for productivity and a method related thereto. Specifically, the invention provides a bacterium comprising phosphobutyryltransferase (Ptb) and butyrate kinase (Buk) (Ptb Buk), which acts on non-natural substrates to produce various products and intermediates. In some embodiments, the present invention relates to the introduction of Ptb_Buk into C1-fixed microorganisms capable of producing products from gaseous substrates.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含产能发酵途径的基因工程菌相关申请的交叉参考本申请要求2015年10月13日提交的美国临时专利申请第62/240,850号的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术介绍
随着发酵和代谢工程的最新发展，已鉴别和研发出各种产物的发酵方式(Clomburg,《应用微生物学与生物技术》(ApplMicrobiolBiotechnol),86:419-434,2010；Peralta-Yahya,《生物技术杂志》(BiotechnolJ),5:147-162,2010；Cho,《生物技术进展》(BiotechnolAdv),pii:S0734-9750(14)00181-5,2014)。但是，这些发酵方式全都是能量(ATP)消耗型或最多能量(ATP)中性的，这限制了能量有限系统中的产物产率并且将产物产生与微生物生长拆开。本专利技术提供能量(ATP)产生途径，所述途径通过为各种产物提供新颖的发酵方式和途径来克服这些限制，产物包括酸、烯烃、醛、醇以及二醇。这些途径直接与微生物生长联系起来并提供高产物产率。具体来说，本专利技术涉及包括Ptb-Buk的发酵途径。磷酸丁酰转移酶(Ptb)(EC2.3.1.19)天然催化丁酰辅酶A和磷酸盐的反应，形成辅酶A和丁酰基磷酸盐。丁酸激酶(Buk)(EC2.7.2.7)天然催化丁酰基磷酸盐和ADP的反应，形成丁酸盐(butyrate/butanoate)和ATP。因此，这些酶一起(Ptb-Buk)天然催化丁酰辅酶A到丁酸盐的转化并通过底物水平磷酸化(substratelevelphosphorylation，SLP)产生一个ATP。本专利技术人已发现，Ptb是混杂的并且能够接受各种酰基辅酶A和烯酰基辅酶A作为底物，使得Ptb-Buk可用于将多种酰基辅酶A和烯酰基辅酶A分别转化为其相应的酸或烯酸，同时通过底物水平磷酸化产生ATP。此外，结合醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)和醇脱氢酶，通过Ptb-Buk系统形成的酸能被进一步转化为其对应的醛、醇或二醇。AOR(EC1.2.7.5)催化酸和还原型铁氧还蛋白(举例来说，它可以从CO或氢气的氧化产生)的反应，形成醛和氧化型铁氧还蛋白。醇脱氢酶(EC1.1.1.1和EC1.1.1.2)能够将醛和NAD(P)H转化为醇和NAD(P)。因此，向异源物种中引入Ptb-Buk和/或AOR能够提供一种以高产率形成如酸、烯烃、酮、醛、醇以及二醇的天然和非天然产物的新颖替代方式，从而克服现有技术的限制。
技术实现思路
本专利技术提供一种基因工程菌，其包含外源性磷酸丁酰转移酶(Ptb)和外源性丁酸激酶(Buk)(Ptb-Buk)。一般来说，Ptb-Buk作用于非天然底物，例如不同于丁酰辅酶A和/或丁酰基磷酸的底物，并产生非天然产物，例如不同于丁酰基磷酸盐或丁酸盐的产物。在某些实施例中，Ptb-Buk将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸，将3-羟基异戊酰辅酶A转化为3-羟基异戊酸，将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸，或将2-羟基异丁酰辅酶A转化为2-羟基异丁酸。细菌可产生酸、烯烃、酮、醛、醇或二醇中的一种或多种。更具体来说，细菌可产生以下中的一种或多种：丙酮或其前体、异丙醇或其前体、异丁烯或其前体、3-羟基丁酸或其前体、1,3-丁二醇或其前体、2-羟基异丁酸或其前体、己二酸或其前体、1,3-己二醇或其前体、3-甲基-2-丁醇或其前体、2-丁-1-醇或其前体、异戊酸盐或其前体、或异戊醇或其前体。细菌典型地不产生丁醇。细菌可进一步包含磷酸转乙酰酶(Pta)和乙酸激酶(Ack)中的破坏性突变(disruptivemutation)。细菌可进一步包含硫酯酶中的破坏性突变。在另一个实施例中，本专利技术提供一种包含外源性Ptb-Buk和外源性或内源性醛:铁氧还蛋白氧化还原酶的基因工程菌。本专利技术进一步提供一种制造产物的方法，所述方法包含在底物存在下培养前述实施例中的任一个的细菌。产物可以是例如丙酮或其前体、异丙醇或其前体、异丁烯或其前体、3-羟基丁酸或其前体、1,3-丁二醇或其前体、2-羟基异丁酸或其前体、己二酸或其前体、1,3-己二醇或其前体、3-甲基-2-丁醇或其前体、2-丁-1-醇或其前体、异戊酸盐或其前体、或异戊醇或其前体。典型地，底物是气态底物，包含例如CO、CO2和H2中的一种或多种。在一个实施例中，气态底物是合成气。在另一个实施例中，气态底物是工业废气。附图说明图1是用于从乙酰辅酶A制造各种产物的代谢途径的图，产物包括丙酮、异丙醇、异丁烯、3-羟基丁酸、1,3-丁二醇以及2-羟基异丁酸。乙酰辅酶A可以由任何合适的底物产生，如碳水化合物(例如糖)底物或气态底物。在本专利技术中，乙酰辅酶A常常由气态底物产生。粗体箭头指示可以由Ptb-Buk催化的步骤。图2是显示由Ptb-Buk天然催化的反应的图，即将丁酰辅酶A转化为丁酸盐并产生一个ATP。图3是比较辅酶A转移酶、硫酯酶和Ptb-Buk的活性的图。图4是显示经过包含外源基因的质粒修饰的大肠杆菌BL21(D3)中的平均丙酮产量的图。这份数据说明Ptb-Buk有将乙酰乙酰辅酶A在大肠杆菌体内转化为乙酰乙酸的能力。图5是显示携带pACYC-ptb-buk和pCOLA-thlA-adc质粒(表达硫解酶、Ptb-Buk和乙酰乙酸脱羧酶)的大肠杆菌BL21(DE3)的诱导作用的图。图6是一种途径的图，该途径被设计成使用Ptb-Buk用于丙酮产生，同时再循环在(R)-3-羟基丁酰辅酶A的产生过程中产生的还原当量和由Ptb-Buk产生的ATP。图7是显示醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)、铁氧还蛋白以及Adh在自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)中产生1,3-丁二醇的过程中的作用的图。更一般来说，AOR可以用于催化酸到醛的转化，而Adh可以用于催化醛到醇/二醇的转化。图8是显示用于产生(R)-3-羟基丁酸和2-羟基异丁酸的Ptb-Buk的立体特异性的图。图8中的术语“天然”是指天然硫酯酶。图9是显示使用替代途径1，通过3-羟基异戊酰辅酶A和3-羟基异戊酸的Ptb-Buk转化来产生异丁烯的图。图10是显示使用替代途径2，通过3-羟基异戊酰辅酶A和3-羟基异戊酸的Ptb-Buk转化来产生异丁烯的图。图11是显示通过3-丁醛脱氢酶(Bld)产生1,3-丁二醇的图。图12是显示使用Ptb-Buk系统相对于对照，自产乙醇梭菌中的异丙醇产量的图。○pMTL85147-thlA-adc，●pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc。图13A-F是显示在大肠杆菌中采用不同浓度的诱导物IPTG(0、50、100μM)采用模块化质粒产生3-羟基丁酸、乙酸盐、乙醇以及丙酮的图。图13A：pACYC-ptb-buk、pCOLA-thlA-adc、pCDF-phaB。图13B：pACYC-ptb-buk、pCOLA-thlA-adc、pCDF-phaB-bdh1。图13C：pCOLA-thlA-adc、pCDF-phaB-bdh1。图13D：pCOLA-thlA-adc。图13E：pCDF-phaB-bdh1。图13F：pCDF-phaB。图14是质粒pMTL8225-budA::thlA-phaB的质粒图谱。图15是在自产乙醇梭菌中4种克隆(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因工程菌，包含外源性磷酸丁酰转移酶(Ptb)和外源性丁酸激酶(Buk)(Ptb‑Buk)，其中所述Ptb‑Buk作用于非天然底物，产生非天然产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.13 US 62/240,8501.一种基因工程菌，包含外源性磷酸丁酰转移酶(Ptb)和外源性丁酸激酶(Buk)(Ptb-Buk)，其中所述Ptb-Buk作用于非天然底物，产生非天然产物。2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述Ptb-Buk作用于不同于丁酰辅酶A和/或丁酰基磷酸盐的底物。3.根据权利要求1所述的细菌，其中所述Ptb-Buk产生不同于丁酰基磷酸盐或丁酸盐的产物。4.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌不产生丁醇。5.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌产生酸、烯烃、酮、醛、醇或二醇中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌产生以下中的一种或多种：丙酮或其前体、异丙醇或其前体、异丁烯或其前体、3-羟基丁酸或其前体、1,3-丁二醇或其前体、2-羟基异丁酸或其前体、己二酸或其前体、1,3-己二醇或其前体、3-甲基-2-丁醇或其前体、2-丁-1-醇或其前体、异戊酸盐或其前体、或异戊醇或其前体。7.根据权利要求1所述的细菌，其中所述Ptb-Buk将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)，将3-羟基异戊酰辅酶A转化为3-羟基异戊酸(步骤8)，将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)，将2-羟基异丁酰辅酶A转化为2-羟基异丁酸(步骤20)，将巴豆酰辅酶A转化为巴豆酸盐(步骤28)，将乙酰丁酰辅酶A转化为乙酰丁酸盐(步骤33)，或将异戊酰辅酶A转化为异戊酸盐(步骤44)。8.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌产生1-丙醇、1-己醇和1-辛醇中的一种或多种。9.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌是C1固定细菌。10.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌衍生自选自由以下组成的群组的亲本细菌：自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharbutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、二醇梭菌(Clostridiumdiolis)、克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)、巴斯德梭菌(Clostridiumpasterianium)、诺维氏梭菌(Clostridiumnovyi)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、噬纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)、植酵梭菌(Clostridiumphytofermentans)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)以及扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)。11.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌进一步包含外源性或内源性醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)。12.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌进一步包含磷酸转乙酰酶(Pta)和乙酸激酶(Ack)中的破坏性突变(disruptivemutation)。13.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌进一步包含硫酯酶中的破坏性突变。14.一种用于制造丙酮或其前体的基因工程菌，包含：(a)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶以及将乙酰乙酸转化为丙酮(步骤3)的酶，其中所述将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶是Ptb-Buk，或(b)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基丁酰辅酶A(步骤13)的酶、将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)的酶、将3-羟基丁酸转化为乙酰乙酸(步骤15)的酶以及将乙酰乙酸转化为丙酮(步骤3)的酶，其中所述将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)的酶是Ptb-Buk。15.根据权利要求14所述的细菌，其中所述细菌产生丙酮或其前体。16.根据权利要求14所述的细菌，其中所述细菌进一步包含伯醇:仲醇脱氢酶中的破坏性突变。17.一种用于制造异丙醇或其前体的基因工程菌，包含：(a)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶、将乙酰乙酸转化为丙酮(步骤3)的酶以及将丙酮转化为异丙醇(步骤4)的酶，其中所述将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶是Ptb-Buk，或(b)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基丁酰辅酶A(步骤13)的酶、将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)的酶、将3-羟基丁酸转化为乙酰乙酸(步骤15)的酶、将乙酰乙酸转化为丙酮(步骤3)的酶以及将丙酮转化为异丙醇(步骤4)的酶，其中所述将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)的酶是Ptb-Buk。18.根据权利要求17所述的细菌，其中所述细菌产生异丙醇或其前体。19.一种用于制造异丁烯或其前体的基因工程菌，包含：(a)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶、将乙酰乙酸转化为丙酮(步骤3)的酶、将丙酮转化为3-羟基异戊酸(步骤5)的酶以及将3-羟基异戊酸转化为异丁烯(步骤6)的酶，其中所述将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶是Ptb-Buk，或(b)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶、将乙酰乙酸转化为丙酮(步骤3)的酶、将丙酮转化为3-羟基异戊酰辅酶A(步骤7)的酶、将3-羟基异戊酰辅酶A转化为3-羟基异戊酸(步骤8)的酶以及将3-羟基异戊酸转化为异丁烯(步骤6)的酶，其中所述将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶和/或所述将3-羟基异戊酰辅酶A转化为3-羟基异戊酸(步骤8)的酶是Ptb-Buk。20.根据权利要求19所述的细菌，其中所述细菌产生异丁烯或其前体。21.一种用于制造3-羟基丁酸或其前体的基因工程菌，包含：(a)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶以及将乙酰乙酸转化为3-羟基丁酸(步骤15)的酶，其中所述将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶是Ptb-Buk，(b)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基丁酰辅酶A(步骤13)的酶以及将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)的酶，其中所述将3-羟基丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸(步骤14)的酶是Ptb-Buk，或(c)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶以及将乙酰乙酸转化为3-羟基丁酸(步骤15)的酶，其中所述将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶是硫酯酶。22.根据权利要求21所述的细菌，其中所述细菌产生3-羟基丁酸或其前体。23.一种用于制造1,3-丁二醇或其前体的基因工程菌，包含：(a)将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A(步骤1)的酶、将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸(步骤2)的酶以及将乙酰乙酸转化为3-羟基丁酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·科普克，R·O·延森，J·B·Y·H·拜仁道夫，R·E·希尔，D·菊米纳噶，A·P·穆勒，
申请(专利权)人：朗泽科技新西兰有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰,NZ