一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法技术

本发明专利技术公开一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，属于基因工程领域。构建步骤包括，利用热敏型敲除系统在乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZP26(保藏号为CGMCC NO.8665)基因组上整合了异源木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶以及转醛醇酶编码基因；敲除磷酸转酮酶编码基因以阻断副产物乙酸生成；并通过适应性驯化策略显著提高了工程菌株共发酵葡萄糖和木糖的能力。本发明专利技术首次成功实现了乳酸片球菌中木糖代谢路径的构建，得到一株高效共发酵葡萄糖和木糖生产光学纯D‑乳酸的工程菌株，并命名为P.acidilactici ZY15，其保藏号为CGMCC NO.13612。

Construction of D-lactic acid production by co-fermentation of glucose and xylose by Staphylococcus lactis

The invention discloses a method for constructing Staphylococcus lactis co-fermenting glucose and xylose to produce D - lactic acid, which belongs to the field of genetic engineering. The construction steps include the integration of isoxylose isomerase, xylose kinase, transketolase and transaldolase coding genes on the genome of Pediococcus acidilactici ZP26 (CGMCC NO. 8665), the knockout of phosphoketolase coding genes to block the production of acetic acid by-product, and the integration of isoxylose isomerase, xylose kinase, transketolase and transaldolase coding genes on the genome of Pediococcus acidilactici ZP26 (CGMCC NO. 86 Through adaptive domestication strategy, the co-fermentation ability of engineering strains for glucose and xylose was significantly improved. For the first time, the xylose metabolic pathway of S. lactis was successfully constructed, and an engineering strain was obtained, named P. acidilactici ZY15 and its preservation number was CGMCC NO. 13612, for the production of optical pure D lactic acid by co-fermentation of glucose and xylose.

【技术实现步骤摘要】
一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种利用热敏型敲除系统，基于同源重组原理的共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法。
技术介绍
D-乳酸是一种重要的工业化学品，它广泛运用于食品、医药、皮革以及纺织业。近年来，以D-乳酸为前体生产生物可降解性塑料聚乳酸，使得光学纯D-乳酸的需求大大提升。但是，目前世界D-乳酸产量的90％都是由淀粉类原料进行发酵得到的，这就存在“与人争粮”问题。寻找更加便宜的原料进行D-乳酸生产将有助于减少粮食危机。木质纤维素原料是一种价格低廉、来源广泛的可再生生物质能源，利用含量丰富的木质纤维素原料生产D-乳酸是一种非常有前途的选择，并且已经有大量研究开始利用木材、农业废弃物等木质纤维素原料进行D-乳酸生产。木质纤维素的主要组成部分是纤维素(30-60％干重)、半纤维素(20-40％)和木质素(15-25％)。其中纤维素来源的葡萄糖可以被微生物利用进行生物基化学品的生产。半纤维来源的木糖约占木质纤维素来源总糖含量的约30％，然而绝大部分生物炼制菌株都不能利用木糖，这限制了木质纤维素原料进行高浓度生物基化学品生产。本实验室先前工作中，筛选得到一株乳酸片球菌P.acidilaticiDQ2，该菌可以很好的适应木质纤维素体系，并可以利用玉米秸秆原料产生103g/L的乳酸。之后通过基因工程改造敲除了乳酸片球菌P.acidilaticiDQ2基因组上L-乳酸脱氢酶编码基因ldh，得到的工程菌株P.acidilaticiZP26可以利用25％(w/w)固含量的玉米秸秆原料产生77.76g/L的D-乳酸，但其不能利用木糖。如果将木糖代谢路径构建至P.acidilaticiZP26，利用玉米秸秆生产D-乳酸的产量必将大大提高。乳酸菌利用木糖进行乳酸生产一般是通过以下两种路径进行的。(1)磷酸转酮酶路径(PK路径)：木糖在木糖异构酶作用下被异构化为木酮糖，木酮糖在木酮糖激酶作用下磷酸化成5-磷酸木酮糖，然后5-磷酸木酮糖在磷酸转酮酶作用下裂解为三磷酸甘油醛(GAP)和乙酰磷酸，最后前者进入糖酵解路径生成乳酸，而后者进一步转化为副产物乙酸；(2)戊糖磷酸路径(PP路径)：木糖同样在木糖异构酶和木酮糖激酶作用下被转化为5-磷酸木酮糖，5-磷酸木酮糖在转酮醇酶和转醛醇酶的作用下最终转化为GAP进入糖酵解路径生成乳酸。其中PP路径代谢木糖时只产生乳酸，而无副产物乙酸等生成，因此PP路径是进行木糖代谢生成乳酸的最佳路径。目前木糖代谢路径构建以生产D-乳酸只在Lactobacillusplantarum中实现过。Okano等(OkanoK,YoshidaS,YamadaR,TanakaT,OginoC,FukudaH,KondoA.Improvedproductionofhomo-D-lacticacidviaxylosefermentationbyintroductionofxyloseassimilationgenesandredirectionofthePhosphoketolasePathwaytothePentosePhosphatePathwayinL-lactatedehydrogenasegene-deficientLactobacillusplantarum.Appliedandenvironmentalmicrobiology,2009,75(24):7858-7861.)敲除了菌株中L-乳酸脱氢酶编码基因(ldhL1)，和两个磷酸转酮酶编码基因(xpk1和xpk2)，并将异源的转酮醇酶编码基因(tkt)整合至xpk1基因位点处。接着Yoshida等(YoshidaS,OkanoK,TanakaT,OginoC,KondoA.Homo-D-lacticacidproductionfrommixedsugarsusingxylose-assimilatingoperon-integratedLactobacillusplantarum.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2011,92:67-76.)将两个拷贝的异源PxylAB分别整合至ldhL1和xpk2基因位点处，最终得到的工程菌株L.plantarumNCIMB8826ΔldhL1::PxylAB-Δxpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB可以代谢木糖进行同型D-乳酸生产。目前还没有对乳酸片球菌进行木糖代谢路径构建以生产D-乳酸的报道，因此建立一种乳酸片球菌木糖代谢路径构建方法，对于共发酵木质纤维素原料中的葡萄糖和木糖进行D-乳酸生产是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种P.acidilactici中木糖代谢路径构建方法。本专利技术的另一个目的在于构建一株能够高效共发酵葡萄糖和木糖进行D-乳酸生产的P.acidilactici工程菌株。本专利技术实现P.acidilactici中木糖代谢路径构建所采用的技术方案是：首先，选择不同来源的xylAB操纵子以及不同启动子，得到最优的xylAB表达框后，并将xylAB表达框整合至P.acidilacticiZP26已缺失的ldh基因位点处。接着，敲除磷酸转酮酶编码基因pkt以阻断副产物乙酸生成。接着，将磷酸转酮酶(tkt)和转酮醇酶(tal)表达框整合至已敲除的pkt基因位点处。最后，得到的重组菌在木糖为唯一碳源的合成培养基中进行适应性驯化，直至得到一株高效利用木糖的稳定菌株为止。上述基因敲除以及基因整合具体方法是：将构建得到的敲除质粒或整合质粒电转化至P.acidilactici中，然后将重组菌在42℃，添加红霉素的MRS培养基中培养12h后，取菌液稀释106倍涂布于含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，取单菌落转接至无红霉素的MRS培养液中，并在28℃下培养20h后，取菌液稀释106倍涂布于无红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，将长出的单菌落分别点板至不含红霉素的MRS平板上和含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h，将在不含红霉素平板上生长的菌落，而在含红霉素平板上不生长的菌落进行进一步的PCR验证，以确定靶基因是否被敲除或者靶基因是否被整合到相应的基因位点处。上述敲除质粒构建方法是：以P.acidilacticiZP26基因组为模板，PCR得到待敲除靶基因的上下游同源臂，然后通过酶切连接分别连接至热敏型敲除质粒pSET4E上。上述整合质粒构建方法是：以P.acidilaticiDSM20284基因组为模板，PCR得到待整合的靶基因，以P.acidilacticiZP26基因组为模板，PCR得到待整合位点处基因的上下游同源臂，首先将上下游同源臂分别连接至pSET4E上，得到敲除质粒，然后将待整合的靶基因连接至敲除质粒的上下游同源臂之间，得到整合质粒。上述适应性驯化具体方法是：将整合了木糖代谢路径的工程菌株接种至MRS液体培养基中，培养12h后，以10％的接种量接种至含木糖为唯一碳源的MRS液体培养基中(添加CaCO3调节pH)，培养36h，以10％接种量转接至新鲜含木糖为唯一碳源的MRS液体培养基中继续培养36h，期间不断进行转接，直至发酵液中残留的木本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，步骤包括：(1)启动子与xylAB基因簇的优化：木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的编码基因是进行木糖代谢的两个最主要基因，xylA和xylB基因的表达水平直接决定了木糖的代谢速率，因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB对xylAB的基因表达水平进行了优化。(2)xylAB基因组整合表达：将步骤(1)中得到的最优的xylAB表达框，通过同源重组整合至乳酸片球菌ZP26基因组上。(3)磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除：在步骤(2)得到的菌株基础上，通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt，以减少副产物乙酸生成。(4)转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合：在步骤(3)得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶基因(tkt)和转醛醇酶基因(tal)整合至其基因组上。(5)适应性驯化：将步骤(4)得到的菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。

【技术特征摘要】
1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法，步骤包括：(1)启动子与xylAB基因簇的优化：木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的编码基因是进行木糖代谢的两个最主要基因，xylA和xylB基因的表达水平直接决定了木糖的代谢速率，因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB对xylAB的基因表达水平进行了优化。(2)xylAB基因组整合表达：将步骤(1)中得到的最优的xylAB表达框，通过同源重组整合至乳酸片球菌ZP26基因组上。(3)磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除：在步骤(2)得到的菌株基础上，通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt，以减少副产物乙酸生成。(4)转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合：在步骤(3)得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶基因(tkt)和转醛醇酶基因(tal)整合至其基因组上。(5)适应性驯化：将步骤(4)得到的菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。2.根据权利要求书1，其特征在于，步骤(1)中使用的表达质粒为pMG36e。3.根据权利要求书1，其特征在于，步骤(1)所述的启动子为PldhD和Pldh，分别是乳酸片球菌ZP26基因组上D-乳酸脱氢酶编码基因(ldhD)和L-乳酸脱氢酶编码基因(ldh)起始密码子上游约300bp的启动子序列。4.根据权利要求书1，其特征在于，步骤(1)所述的xylAB基因簇分别为：xylAB_2911，xylAB_3089和xylAB_pp，其中xylAB_2911和xylAB_3089来源于乳酸片球菌DSM20284，xylAB_pp来源于戊糖片球菌ATCC25745。5.根据权利要求书1，其特征在于，步骤(1)优化得到的表达框为PldhD_xylAB_2911。6.根据权利要求书1，其特征在于，步骤(2)、(3)和(4)中使用的敲除和整合质粒均为热敏型敲除质粒pSET4E。7.根据权利要求书1，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍杰，邱忠洋，高秋强，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31